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草鱼生长激素和植酸酶的融合基因大量表达产物分析-论文答辩

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草鱼 生长激素 植酸酶 融合 基因 大量 表达 产物 分析 论文答辩
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内容提纲,研究背景及意义,实验方法及步骤,实验结果及分析,讨论,研究背景及意义,1.市场饵料添加剂污染严重且有富集作用,对人体有害。,研究背景及意义,2.草鱼生长激素参与鱼体生长代谢,能够加速蛋白质合成和脂类降解等生理功能。,研究背景及意义,3.植酸酶降低磷对环境的污染并消除植酸的抗营养作用,同时改善动物对蛋白质和矿物质等营养物质的利用率。,研究背景及意义,草鱼生长激素和植酸酶的融合基因的融合蛋白,促生长 √污染小 √高表达 √大量提取 √,实验方法及步骤,,,,,,,,,,,,100ml,250ml,500ml,IPTG,恒温振荡培养箱,1.菌株培养,实验方法及步骤,2.蛋白样品制备,,,,离心,超声波破碎,离心,沉淀,上清,PBS,实验方法及步骤,3.SDS-PAGE电泳分析比较,4.蛋白纯化,5.蛋白定量,实验结果及分析,,,,,,,,pET-28a,H17,PHY,HAP,实验结果及分析,H17,PHY,HAP,,,,28KDa,52KDa,80KDa,实验结果及分析,实验结果及分析,蛋白浓度H17 为1.55 mg/mL,PHY为 1.852 mg/mL,HAP 为1.414mg/mL,总共提取分别得到约H17 为7.75mg,PHY 为9.26mg,HAP 为7.07mg目的蛋白。,讨论,重组蛋白在大肠杆菌中的表达形式可分为三种:1.胞外分泌表达,2.周质空间表达,3.胞内表达,HAP主要以第三种胞内表达为主,这种表达易形成无活性的包涵体,需要经过复杂的变性和复性才能得到有活性的蛋白。当在大肠杆菌中大量表达外源蛋白时,表达的蛋白容易形成包涵体,不利于纯化及后续的酶活性检测或酶学性质研究。,讨论,提高重组基因表达蛋白HAP可溶性表达的方法:1.选择适合的载体和宿主菌;2.降低重组蛋白合成的速率;3.改变培养基成分;4.与分子伴侣或折叠酶共表达;5.通过替换氨基酸增加可溶性等。,,,
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