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L-arginine对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞衰老的作用及机制研究.pdf

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高糖 脐静脉内皮细胞 衰老作用 LARGININE 端粒酶
资源描述:
现今糖尿病已成为严重危害人类健康的全球流行性疾病其血管并发症是患者致残、致死的主要因为。与非糖尿病人群相比糖尿病人群中动脉粥样硬化性疾病的患病率高、发病年龄轻、病情进展较快多脏器同时受累较多。一些研究指出高血糖可以加速细胞的衰老而内皮细胞衰老是动脉粥样硬化的早期病理改变因此研究高糖致内皮细胞衰老的机制从而发展有效阻断药物是防治糖尿病大血管病变的有效途径。  内皮细胞是糖尿病血管病变的关键靶组织。它不仅在抗凝血因子形成过程中起着保护屏障作用而且其自身可分泌因子调节血管管腔和保持内环境稳态的作用。正常生理状态下内皮细胞的更新率很低分裂增殖能力有限但因损伤(如高糖刺激)导致细胞不断的分裂将引起端粒缩短细胞进入衰老期表现为SAβgal活性增强、细胞停滞在细胞周期的G0G1期、衰老相关的基因和蛋白表达阳性以及端粒酶活性降低等;同时血管内皮细胞衰老过程中分泌的各种生物学活性因子也在发生变化如NO的合成下降、炎性因子合成增加、粘附因子表达增多等。这些变化都将造成内皮细胞功能障碍最终导致动脉粥样硬化的发生。可见衰老与糖尿病相关的动脉粥样硬化存在密切关系。  端粒钟学说是衰老发生机制的学说之一。端粒是真核细胞染色体末端的DNA序列随着细胞的每次分裂端粒不断缩短当缩短到一个阈值时便不能维持染色体的稳定使细胞失去分裂增殖能力而进入了衰老阶段。因此端粒缩短被认为是触发细胞衰老的分子钟可作为衰老的生物标记。端粒酶是一种核糖核蛋白逆转录酶可以在缩短的端粒末端加上新的重复序列保持端粒长度在调节寿命与细胞增殖方面扮演着重要的角色。端粒酶活性的调控是多因素的PI3KAkt通路正是其中之一。对黑色素细胞瘤细胞系SKMEL28的研究发现在无血清培养24小时后肿瘤细胞Akt活性升高端粒酶的活性增加2倍而端粒酶逆转录酶催化亚基(HumanTelomeraseReverseTranaseSubunithTERT)的两个XXRXRXXSXX序列也相应出现了磷酸化;应用PI3K抑制剂可以降低肿瘤细胞端粒酶的活性并抑制hTERT的磷酸化。因此Akt必然成为端粒酶十分重要的上游调节点。  氧化应激的增加与NO生物利用度的减少在细胞衰老中起着重要的作用。有研究显示高糖可以增加细胞内ROS的产生而后者可通过抑制Src家族激酶的活性而缩短端粒的长度加快衰老的进程。NO能与过量的ROS反应而减轻细胞氧化应激的程度。NO被认为是最主要的内皮源性自分泌因子它可以调节血管管腔大小抑制血小板聚集、抗凋亡、抑制平滑肌细胞增殖和白细胞粘附因而在抗动脉粥样硬化过程中发挥着重要的作用。很多研究发现内皮型NOS(eNOS)的表达和NO的合成随年龄的增加而下降虽然其机制目前还不明确但有研究表明PI3KAkt可以介导eNOS的磷酸化亦有研究显示2型糖尿病患者内皮功能紊乱与PI3KAkteNOS通路受到抑制有关。因此在内皮细胞中上调PI3KAkt信号系统应是防治糖尿病大血管病变的一个重要靶点。  LArg是NO合成的前体物质在1992年Creager和DuboisRarde两组学者首次断定补充eNOS作用的底物LArg是增加内皮产生生物活性NO的一种方法。LArg改善内皮细胞功能的机制相对多样化尚未阐明这种作用可能与增力INO的合成和eNOS蛋白表达减少ROS的形成有关。  综上所述本实验在体外模拟高糖状态观察高血糖是否加速人脐静脉内皮细胞衰老其对NO、eNOS蛋白表达及转录水平的影响以及与PI3KAkt信号通路的关系而LArg是否可以延缓高糖加速的内皮细胞衰老的进程其作用机制是否与PI3KAkt通路有关为进一步探讨糖尿病大血管病变发病机制及其防治手段提供实验依据。  材料与方法:  1、人脐静脉内皮细胞株培养不同浓度的葡萄糖溶液孵育细胞、高糖(33mM)和或不同浓度Larginine共同孵育细胞以及同一浓度孵育不同的时间收集内皮细胞及细胞培养液;分别用PI3KAkt特异性抑制剂LY294002、eNOS特异性抑制剂LNAME进行预处理2h然后于上述因素孵育细胞收集内皮细胞及细胞培养液用于指标检测。  2、衰老相关的β半乳糖苷酶活性检测是通过染色计算阳性细胞的百分比来确定后者是指1000个细胞中被染成蓝绿色细胞的百分比。  3、采用PCRELISA法检测端粒酶的活性。  4、应用流式细胞术检测活性氧及分析细胞周期。  5、应用RTPCR技术检测PI3K、Akt、eNOSmRNA的表达。  6、采用Westemblot法检测人脐静脉内皮细胞pAkt(Ser473)、Akt、peNOS(Ser1177)、eNOS蛋白的表达。  7、采用硝酸盐还原酶还原硝酸盐为亚硝酸盐然后通过经典的Griessreagent检测亚硝酸盐从而测定出总一氧化氮。  结果:  1、随着糖浓度的增加(即5.5、11、22、33mmolL)SAβgal活性逐渐增强(P  2、随着糖浓度的不断增加细胞内ROS逐渐增多(P  3、与正常对照组相比33mmolL糖浓度组72hPI3K、Akt、eNOSmRNA的表达明显下降(P  4、与正常对照组相比33mmolL糖浓度组48hpAkt(Ser473)Akt、peNOS(Ser1177)eNOS蛋白表达量的比值明显减弱(P  5、应用不同浓度Larginine(0.4、0.8、1.6mmolL)与高糖(33mmolL)共同干预细胞不同程度地减弱了SAβgal活性(与高糖组比较P  6、与高糖组比较Larginine(0.4、0.8、1.6mmolL)明显减少细胞内的ROS水平(P  7、与高糖组比较Larginine(0.8mmolL)作用内皮细胞72h使PI3K、Akt、eNOSmRNA的表达明显增强(P  8、与高糖组比较Larginine(0.4、0.8、1.6mmolL)明显增加了pAkt(Ser473)Akt、peNOS(Ser1177)eNOS蛋白的表达量的比值(P  9、PI3KAkt特异性抑制剂LY294002及eNOS特异性抑制剂LNAME可以抑制Larginine的抗衰老作用。  结论:  1、高糖可以明显加快内皮细胞衰老的进程这种作用呈现糖浓度依赖性及时间依赖性。  2、Larginine可以明显延缓高糖加速的内皮细胞衰老进程。  3、Larginine可能通过上调PI3KAkt路径增强端粒酶及eNOS的活性从而发挥抗内皮细胞衰老的作用。
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