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  • 基础医学
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      上传时间:2019-03-29
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    • 简介:目的筛选和研究红细胞分化相关基因并确定其功能是红系分化研究中的重要课题而这,也是我们的实验目的1,EDRF1、2为红细胞分化相关的CDNA克隆,2,EDRF1调控K562、HEL细胞中珠蛋白的表达及其功能通路3,EDRF1是结合HS2核心序列的红系反式作用因子4,EDRF2全长基因的获得及功能研究5,EDRF2蛋白质三维结构模建及功能活性区的预测6,利用基因芯片技术筛选红细胞分化相关的新基因及功能研究以上研究表明,EDRF1、EDRF2和EDRG1、EDRG2作为红细胞分化相关基因,参与了红白血病细胞K562、HEL细胞的终末分化过程,功能实验研究表明,EDRF1和EDRF2对一系列的红系特异基因的表达水平以及转录因子活性进行了调控,报告基因系统结合基因转染技术研究发现,EDRF1蛋白结合珠蛋白增强子序列HS2的92179267段的DNA,作为一个反式因子参与红细胞终末分化的功能信号传递该研究中通过生物信息学的手段,应用计算机分析和模拟的方法初步展示了EDRF2的可能的蛋白质空间三维结构和特性,为它的进一步的功能研究提供一定的线索
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      上传时间:2019-03-29
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      ( 4 星级)
    • 简介:本研究采用未经细胞培养和传代及人类巨细胞病毒HCMV感染终末器官组织的临床株进行大样本的测序研究,探讨UL144、UL139及UL149基因多态性与先天性HCMV感染不同致病性之间的关系,进一步弄清所编码蛋白的生物学功能,进而为在分子水平上揭示HCMV感染的致病机理奠定基础。研究表明1HCMVUL144、UL139及UL149基因核苷酸及氨基酸序列存在多态性。且与疾病有一定的关系,先天性发育畸形及多脏器受累的临床株以UL144IA基因型为主;无症状或轻微临床表现的临床株以Ⅲ型为主。先天性巨结肠临床株UL144基因型以IA为主;UL139基因型以G3型为主。2在一个HCMV感染的机体内可存在2个不同的UL144基因型;HCMV感染宿主体内的UL144、UL139和UL149基因型高度保守;从尿液中排出的HCMV基因型与HCMV感染终末器官的基因型一致。3预测UL144、UL139及UL149基因编码的重要功能位点与临床有关,UL149的CPK位点可能与HCMV引起的骨髓造血功能异常有关。UL139基因编码的功能位点在46~51氨基酸残基之间的MYR基团高度保守和ACP位点的缺失对于先天性巨结肠的发生可能具有一定的意义。4HCMVUL149基因与UL144基因具有相关性,与UL139基因没有相关性;UL144与UL139亦没有相关性。
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      上传时间:2019-03-29
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    • 简介:目的建立三色法流式细胞术检测T淋巴细胞内细胞因子的方法;探讨核因子ΚB在支气管哮喘患者T淋巴细胞表达TH1/TH2类细胞因子Γ干扰素ΓIFN/白细胞介素4IL4的调控信号传导中的作用。方法1正常人外周血在12肉豆蔻酰13乙酸佛波酯PMA、IONOMYCIN和MONENSIN存在的条件下在体外短期培养,进行细胞膜表面抗原和细胞内细胞因子染色,用流式细胞仪对淋巴细胞内细胞因子进行测定,并对分析方法中细胞膜表面抗体的选择和不同刺激时间对测定结果的影响等进行了探讨。2选取轻中度急性发作期哮喘患者20例,正常对照20例。正常对照组取外周血加入PMA培养。哮喘患者取外周血并分成2组培养。第一组加入PMA,第二组同时加入PMA和核因子ΚB抑制剂二硫代氨基甲醇吡咯烷PDTC。将培养的外周血用三色法流式细胞术检测T淋巴细胞亚群。结果1选用不同的单抗和刺激剂的刺激时间不同,对实验结果有较大影响。2加入PMA培养的哮喘患者T淋巴细胞TH1,TH2,TH1/TH2与正常对照组比较差异有显著性,且与同时加入PMA和PDTC培养的哮喘患者外周血T淋巴细胞组比较也有显著性。哮喘患者TH1细胞、TH1/TH2较正常人明显降低,而哮喘患者的TH2细胞较正常人明显升高。同时加入PMA和PDTC培养的哮喘患者外周血T淋巴细胞组TH1细胞、TH1/TH2较哮喘患者明显升高,TH2细胞明显降低。结论1流式细胞术是单细胞水平检测细胞内细胞因子的较为理想的方法;2细胞内细胞因子检测的影响因素较多,分析时需选择适当的测定条件;3T淋巴细胞活化后使淋巴细胞亚群改变可能是通过核因子ΚB来传导的。T淋巴细胞核因子ΚB信号传导途径的激活可能是哮喘的发病机制之一。
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      上传时间:2019-03-28
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    • 简介:华支睾吸虫成虫长期寄生于肝胆管部位所引起的疾病称华支睾吸虫病,又称肝吸虫病,是一种食源性的人兽共患寄生虫病。华支睾吸虫成虫轻度感染不会产生明显临床症状,易被忽视,患者长期带虫,虫体的分泌/代谢产物及虫体本身的机械刺激,对肝胆系统造成慢性损害,可引起胆管局限性扩张、胆管上皮增生、管壁增厚、管腔狭窄、胆管炎、胆管肝炎和肝硬化甚至诱发肝胆管肿瘤。流行病学调查结果显示华支睾吸虫病并发胆管癌的发生率高达14%476%,并且流行区胆管癌较肝细胞癌更多见;病理学资料表明华支睾吸虫成虫可引起胆管上皮脱落,胆管腺瘤样增生和炎症反应,晚期在腺瘤样增生边缘出现鳞状化生,胆管的腺瘤样增生组织产生退化及纤维化和恶性变;我国珠江三角洲地区的胆管癌患者很多都合并华支睾吸虫感染,有的甚至在癌组织切片中找到华支睾吸虫卵碎片,此种癌多数为低分化癌。人鳞状上皮癌肿瘤相关基因SQUAMOUSCELLCARCINOMARELATEDONCOGENE,SCCRO研究发现,该基因定位于人类染色体3Q263上,氨基酸序列含有螺旋环螺旋亮氨酸拉链结构,此结构与核转录因子类癌基因相类似,具有潜在转录因子作用。SCCRO转染的裸鼠具有形成未分化侵袭瘤的作用,并且与局部的淋巴结转移相关。SCCRO的大量表达与人类多种鳞状上皮癌的侵袭,转移密切相关。尽管有充分的证据表明,华支睾吸虫的感染是引发肝胆管癌的一个重要因素,但是至今仍缺乏明确的分子水平的实验证据;另一方面,华支睾吸虫是否存在与人鳞状上皮癌肿瘤相关基因相类似的基因,是否也具有与其相类似的作用都值得进一步探讨。研究目的从华支睾吸虫成虫CDNA文库中筛选出与人鳞状上皮癌肿瘤相关基因相类似的基因,探讨其与肝胆管癌发生、发展的关系,为华支睾吸虫感染引起肝胆管肿瘤提供分子生物学依据,同时丰富华支睾吸虫基因组学和功能基因组学研究。研究方法1华支睾吸虫CSSCCRO基因的发现和生物信息学分析从华支睾吸虫成虫CDNA文库测序后UNIGENE归并、拼接,获得与人鳞状上皮癌相关肿瘤基因相类似的基因,暂命名为CSSCCRO。测序、分析是否为全长基因,然后利用生物信息学分析软件对此基因的CDNA序列进行结构、性质和功能分析,包括核酸水平和氨基酸水平的同源性分析、以及推导的CSSCCRO蛋白的理化性质及空间结构分析。2华支睾吸虫CSSCCRO基因克隆、表达和WESTERNBLOTTING鉴定21华支睾吸虫成虫CSSCCRO基因的扩增、克隆根据目的基因的ORF和原核表达质粒PET30A设计引物,PCR扩增CSSCCRO基因的CDNA全长编码区。限制性内切酶XHOⅠ、ECORⅤ双酶切空质粒PET30A和PCR产物,T4连接酶连接。用PCR、酶切及测序鉴定。22华支睾吸虫成虫CSSCCRO基因的表达和纯化将PET30ACSSCCRO重组质粒转化的大肠杆菌BL21中表达,IPTG诱导后超声裂解破碎,最后用NINTAAGAROSE蛋白纯化柱纯化目的蛋白,核酸蛋白定量分析仪DU530BECKMAN测浓度。23华支睾吸虫成虫CSSCCRO蛋白的WESTERNBLOTTING鉴定采用SDSPAGE电泳和WESTERNBLOTTING方法,一抗分别用长期感染华支睾吸虫的猫血清和轻度感染的大鼠血清均为1100稀释,以GST1为阳性对照,来检测CSSCCRO蛋白的免疫原性。3华支睾吸虫CSSCCRO的细胞生物学功能初步研究31CSSCCRO蛋白刺激大鼠卵圆细胞的作用探讨将卵圆细胞接种于96孔板,待细胞生长稳定后按一定浓度加入目的蛋白刺激,以PBS为阴性对照进行MTT试验。在细胞生长的12H、24H、36H、48H、60H等五个时间点检测细胞492NM的吸光度,来反映细胞的生长变化;提取实验组和对照组细胞的总MRNA,通过RTPCR检测肿瘤转移相关基因CMYC和CD44表达量的变化。32将CSSCCRO基因转染入HELA细胞和大鼠肝卵圆细胞作用探讨构建PEGFPN1CSSCCRO真核重组质粒,脂质体法转染PEGFPN1CSSCCRO入HELA细胞和大鼠肝卵圆细胞,荧光倒置显微镜观察CSSCCRO的表达,为进一步的功能研究打下基础。研究结果1华支睾吸虫CSSCCRO基因的编码序列结构分析从华支睾吸虫成虫CDNA文库中发现与人鳞状上皮癌肿瘤相关基因相类似的基因,暂命名为CSSCCRO;CSSCCRO是完整的全长基因,该基因全长1218BP。其ORF含碱基780BP,起始密码子为ATG,终止密码子为TGA,编码259个氨基酸。其推导氨基酸序列与人鳞状上皮癌基因编码蛋白一致性达到50%,保守功能域分析发现该序列含有螺旋环螺旋亮氨酸拉链结构,与核转录因子类癌基因相似;其编码氨基酸理论分子量为30500,理论PI值546。2华支睾吸虫CSSCCRO基因克隆、表达和WESTERNBLOTTING鉴定用设计的引物PCR从CDNA文库中扩增CSSCCRO编码区CDNA序列,用琼脂糖电泳鉴定在略大于750BP处,测序确定为780BP。定向克隆获得的重组原核表达质粒PET30ACSSCCRO经PCR、双酶切和/或测序证实构建成功。重组质粒在IPTG终浓度1MMOL/L,28℃下诱导表达可溶性重组融合蛋白,经SDSPAGE显示与目的蛋白分子量相符,重组蛋白经亲和层析纯化后得到纯化后的目的蛋白。WESTERNBLOTTING证实长期自然感染华支睾吸虫的猫血清能与原核表达的CSSCCRO蛋白相结合,说明在华支睾吸虫长期感染过程中目的蛋白可以刺激机体产生抗体,具有一定的免疫原性。对于轻度感染华支睾吸虫的大鼠血清则不能与目的蛋白相结合,提示目的蛋白不宜作为感染早期诊断分子。3华支睾吸虫CSSCCRO的细胞生物学功能初步研究CSSCCRO蛋白刺激大鼠卵圆细胞的MTT结果显示目的蛋白在适当的浓度下利于细胞大鼠肝卵圆细胞的生长,。半定量PCR结果表明目的蛋白刺激后CMYC的表达量轻度升高,而CD44表达量则无明显变化。CSSCCRO能够在HELA细胞中高效表达,而在大鼠肝卵圆细胞中则很难见到绿色荧光蛋白的表达。这一方面可能与CSSCCRO蛋白对大鼠肝卵圆细胞有一定的毒性有关,另一方面,也可能与大鼠肝卵圆细胞自身特性不适于脂质体转染有关。研究结论1首次在华支睾吸虫中发现了与人鳞状上皮癌相关肿瘤基因同源性较高的基因,暂命名为CSSCCRO。2CSSCCRO蛋白能够促进大鼠肝卵圆细胞的生长,并且使肿瘤转移相关基因CMYC的表达量增加。这提示CSSCCRO在诱导肝胆管癌的发生、发展方面具有一定作用,也说明新发现基因暂命名为CSSCCRO有一定的可靠性。3CSSCCRO蛋白能被华支睾吸虫长期自然感染猫血清识别,却不能被短期轻度感染华支睾吸虫的阳性大鼠血清识别。这提示CSSCCRO可能为晚期感染相关因子,是否与感染晚期发生的肝硬化、肝胆管癌有关还有待进一步研究。
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      上传时间:2019-03-28
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    • 简介:●●●分类号聊弓密级单位代码10422学号沙口7/罗/圹∥1|I●T,厶蒙夕;孥硕士学位论文SHANDONGUNIVERSITYMASTER’STHESIS论文题目U形病喜雠缝爰们孑耕挑√舷膊动能丝.千恸一6叫‘M溉朔腑曳漱锄训纠‘作者姓名专业导师合作导师艘上U鞋硪O/O年D岁月汐日么I觑L多●●●原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅;本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。保密论文在解密后应遵守此规定⋯⋯触新虢驻⋯巡虚差上母嘲.
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      上传时间:2019-08-16
      页数: 82
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    • 简介:为阐明不育男性患者体内是否存在抗FSH自身抗体,我们建立了特异性和灵敏度较高的抗FSH自身抗体的ELISA检测方法,并对部分不育男性患者和正常生育人群血清抗FSH自身抗体进行了测定,发现抗FSH自身抗体在无、少、弱精子症患者中的分布频度较高,在无精子症患者中尤为显著,说明抗FSH自身抗体在部分男性不育患者中存在,且可能是致男性无、少、弱精子症的又一致病因素。为进一步研究抗FSH自身抗体对雄性生殖系统的影响,我们用合成多肽建立了抗FSH自身抗体大鼠模型,发现模型大鼠生精小管内生精细胞数量及管腔内精子数量均减少,且附睾尾精子数量和肿胀精子百分率均显著降低,同时发现附睾头部异常精子数量增多。表明抗FSH自身抗体确实对大鼠睾丸的生精功能产生了影响。在以上研究基础上,我们又检测了模型大鼠血清激素水平并观察了睾丸细胞凋亡情况,以探讨抗FSH自身抗体引起睾丸生精功能降低的可能机制。实验结果显示,模型大鼠免疫第77D和91D时血清FSH水平显著降低,免疫第105D时,FSH水平有所回升。与对照组相比,各时间段模型大鼠血清INHIBINB水平显著降低,血清LH水平无明显变化。荧光定量PCR和TUNEL检测结果发现,各时间段模型大鼠睾丸内BAX与BCL2MRNA水平的比值、CASPASE3MRNA水平以及生精细胞凋亡指数均显著高于对照组。据此我们推测,抗FSH自身抗体可能通过与体内FSH形成抗原抗体免疫复合物而引起外周血中FSH水平下降,进而可能影响支持细胞的分泌活动,激活与BAXCASPASE3相关的信号通路或其它可能的凋亡途径,诱导生精细胞凋亡,导致睾丸生精功能低下。抗FSH自身抗体在体内的长期存在可能会引起机体某种代偿机制的形成,从而睾丸生精功能可能得到一定程度的恢复。
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      上传时间:2019-03-28
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      上传时间:2019-03-28
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    • 简介:细胞分泌功能通过囊泡胞吐过程来完成。囊泡胞吐过程是一个涉及许多蛋白质、脂质分子等物质并有多个细胞器参与的复杂过程,由囊泡的生成、成熟、募集、拴系和锚定、囊泡的激活、最后囊泡与细胞膜融合及其内含物通过融合孔释放至胞外等步聚组成。SNARE蛋白核心复合体是膜融合的分子基础,为膜融合提供能量。CA2是调节性分泌的触发信号,SYNAPTOTAGMIN是囊泡膜融合过程的CA2感受蛋白,它与SNARE蛋白一起组成膜融合的最小分子构件。细胞胞吐活动受到一些调节蛋白,如ΑSNAP、NSF、MUNC18/NSEC1、MUNC13、RAB蛋白及效应物RABPHILIN、RIM和NOC2等和钙结合蛋白如CALMODULIN和CAPS等的调控。囊泡的“激活”是囊泡获得与靶膜融合能力的过程。它是低浓度钙数百纳摩尔和磷脂酰肌醇代谢产物依赖性的耗能过程,需要ATP水解提供自由能。囊泡激活过程受到CA2、二酰甘油、MUNC13、蛋白激酶A和蛋白激酶C、SV2A、NSF以及SNAPIN等信号分子和蛋白质的调控。在CA2依赖的调节性分泌活动中,囊泡的激活过程是限速性步骤。激活囊泡的数目代表可释放囊泡库的大小。可释放囊泡库的大小取决于未激活囊泡库的大小以及激活、去激活和消耗即囊泡融合的速率。囊泡激活的分子机制目前还不是十分清楚,可能是SNARE蛋白聚合形成的TRANS异位SNARE复合体或TRANS同位SNARE蛋白复合体与钙离子感受蛋白SYNAPTOTAGMIN相互作用形成的复合物赋予了囊泡与靶膜融合的能力。SNAPIN是新近发现的与SNAP25结合的小分子15KD蛋白,为普遍表达的胞浆蛋白。SNAPIN与SNAP25结合并促进SYANAPTOTAGMIN与SNARE复合体的结合。SNAPIN通过超螺旋与SNAP25、SNAP23和非神经元性的SNAP25同功型结合。也可能与RGS7、腺苷酸环化酶Ⅵ、EBAG9产物和受体酪氨酸激酶MET相互作用。在背根神经节细胞,SNAPIN和SYNAPTOTAGMINⅨ均与VANILLOID受体1VANILLOIDRECEPTOR1,TRPV1发生相互作用,调节PKA介导的TRPV1通道向细胞膜的募集过程,其调节作用可能通过调节SNARE蛋白复合体依赖的胞吐过程来实现。SNAPIN也是溶酶体相关细胞器生物发生蛋白复合物BIOGENESISOFLYSOSOMERELATEDORGANELLESCOMLEX1,BLOC1的亚单位,因而也可能参与对细胞胞吞活动的调节。实验采用同源重组方法产生失效突变,使SNAPIN基因不表达-即SNAPIN基因敲除,采用生物化学方法研究SNAPIN蛋白的缺失对与分泌相关的必需蛋白质和调节蛋白的表达水平、SNARE蛋白的聚合反应和SYNAPTOTAGMIN与SNARE复合体相互作用的影响。生物化学实验结果显示SNAPIN缺失不影响已知参与突触囊泡胞吐活动的必需蛋白质和调节蛋白的表达,表明SNAPIN基因敲除不会引起为神经元轴突末梢递质释放所必须的蛋白质的代偿性表达变化。此外,SNAPIN缺失也不影响SNARE蛋白的聚合反应。与野生型同胎小鼠相比较,基因敲除小鼠脑匀浆中的SYNAPTOTAGMIN1与SNAP25的结合显著降低34±3﹪,FROM11LITTERMATES,P001。实验使用高时间分辨率的膜电容测量法测量囊泡与细胞膜的融合并同时使用微碳纤电化学检测法检测儿茶酚胺的释放,研究SNAPIN对嗜铬细胞分泌动力学和钙离子依赖性的影响;用高强度的短暂紫外光来裂解NPEGTA使细胞胞浆的游离钙离子浓度瞬时升高到某一较高浓度并维持一段时间,快速刺激细胞分泌。实验结果表明SNAPIN基因敲除小鼠嗜铬细胞胞吐簇发相的幅度显著减少而持续相没有变化,野生型SNAPIN在基因敲除细胞中的过表达可以完全消除SNAPIN基因的敲除对胞吐的抑制作用,使胞吐簇发相恢复到野生型细胞的水平。电子显微镜观察和分析显示SNAPIN基因敲除对嗜铬细胞囊泡的数目和空间分布没有影响,即囊泡的锚定不受影响。RAMP实验结果显示SNAPIN的缺失不改变囊泡胞吐的钙离子敏感性和协同作用,即胞吐的钙依赖性没有改变。因此,SNAPIN基因敲除小鼠的生物化学和电生理研究表明SNAPIN参与对囊泡胞吐活动的调节,其分子机制可能是促进SYNAPTOTAGMIN与SNARE复合体的相互作用,稳定SYNAPTOTAGMINSNARE复合物,降低激活过程的逆反应去激活速率,从而稳定激活囊泡,维持可释放囊泡库的正常大小。简要地介绍了细胞分泌研究领域常用的几种先进生物物理技术和手段;描述了全内反射荧光显微镜的构建和消散场的校准。用全内反射荧光显微成像技术观察了PC12细胞单个囊泡的锚定、去锚定和与细胞膜的融合,为囊泡锚定是可逆性过程的学说提供了直接的观察证据。
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      上传时间:2019-03-28
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    • 简介:本研究用二维电泳和免疫印迹法分离并鉴定细胞内磷酸化和非磷酸化的肌动蛋白;然后用特异性的单克隆抗磷酸化丝氨酸或抗磷酸化苏氨酸或抗磷酸化酪氨酸抗体确定肌动蛋白磷酸化氨基酸残基的种类,从而探讨ATP缺乏时兔肾脏近端小管上皮细胞内肌动蛋白磷酸化与肌动蛋白捕获间的关系。本研究结果发现,兔肾脏近端小管上皮细胞在ATP缺乏时,几乎有一半被捕获的肌动蛋白处于磷酸化状态;进一步的研究发现肌动蛋白的磷酸化是发生在丝氨酸残基上的;磷酸化的肌动蛋白存在于细胞骨架部分,而不存在于细胞浆内,在ATP缺乏时兔肾脏近端小管上皮细胞内肌动蛋白的磷酸化与肌动蛋白的捕获密切相关。
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      上传时间:2019-03-28
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      上传时间:2019-03-28
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    • 简介:日前,与环境致癌物相关的肿瘤发病率呈上升趋势,准确地检测环境中的致癌物是预防和治疗癌症的重要任务之一。致癌物包括遗传毒物和非遗传毒物。遗传毒物通过损伤遗传物质DNA而起细胞毒作用。非遗传毒物包括一些细胞毒素、免疫抑制剂等等,它们不通过与DNA作用而促进癌症的发生。迄今所知的大多数致癌物都是遗传毒物,它们对DNA的损伤包括DNA单链断裂DNASINGLESTRANDBREAKS,SSBS、双链断裂DNADOUBLESTRANDBREAKS,DSBS、DNA加合物形成、链内/链间交联及碱基置换等等,其中DSBS被认为是最严重的损伤方式之一。因此,如何准确对DSBS的检测有助于癌症的预防和治疗。近年来研究发现,DSBS出现后,组蛋白家族成员H2AXC端139位丝氨酸残基SER可被磷脂酰肌醇3激酶PHOSPHATIDYLINOSITOL3KINASE,PI3K样家族成员磷酸化形成ΓH2AXGAMMAH2AX。ΓH2AX可以募集其它DNA修复蛋白到损伤位点,形成焦点FOCI结构,共同完成DNA修复过程。在电离辐射IR后,在损伤位点快速形成ΓH2AX焦点,并且焦点的数量与IR造成的DSBS的数量存在一一对应关系,表明ΓH2AX焦点的形成可用于检测IR诱导的DSBS。另外发现,其它间接导致DSBS的遗传毒物如顺铂、喜树碱也诱导ΓH2AX焦点的形成。因此,直接或者间接导致的DSBS的产生都能诱导ΓH2AX焦点的形成。ΓH2AX焦点与DSBS之间的密切关系表明ΓH2AX极有可能成为检测细胞DNA损伤特别是DSBS的一个新的特异性指标。苯并A芘BAP是典型的强致癌性的多环芳烃类化合物,是一种间接遗传毒物,进入体内需经过细胞色素P450家族代谢活化才呈现强致癌作用。其终代谢产物二氢二醇环氧苯并芘BPDE可以与DNA共价结合,最终导致细胞生长分化功能失调而癌变。咪唑硫嘌啉AZA、环孢素霉ACSA是临床上常用的免疫抑制剂,主要用于移植后的排斥反应。它们可以促进细胞的坏死,对细胞的损伤不通过遗传物质DNA,是非遗传毒物质。由于ΓH2AX极有可能成为检测细胞DNA损伤特别是DSBS的一个新的特异性指标,我们选择了一系列的物理/化学因素作用于人羊膜上皮FL细胞,研究细胞在不同处理因素作用下ΓH2AX焦点的形成情况。本研究基于这个基础上,研究间接遗传毒物BAP,非遗传毒物AZA/CSA损伤细胞后ΓH2AX焦点形成情况。我们用MTT比色法观察了各种浓度的BAP001,01,1,10,20,50,100ΜM及AZA20ΜG/ML、CSA20ΜG/M对FL细胞的毒性作用,发现各浓度的BAP对FL细胞生存率没有明显影响,20ΜG/ML的AZA和CSA则具有明显的细胞毒作用。通过免疫荧光实验发现,在各浓度的BAP01,1,10,50ΜM处理细胞10MIN、2H,没有明显诱导ΓH2AX焦点形成。8H、24H时,则有明显诱导了ΓH2AX焦点的形成,并且有明显的时间、剂量依赖效应,最高浓度50ΜM作用后,焦点形成最多、最强。24H时甚至也比8H时候有更多的细胞中含有ΓH2AX焦点。我们还发现,在50ΜMBAP作用后,有大量的微核MICRONUCLEI形成。而20ΜG/MLAZA/CSA作用FL细胞后检测ΓH2AX焦点,发现与对照相比,ΓH2AX焦点数量没有显著变化。通过中性彗星实验发现BAP能诱导细胞DSBS,而AZA/CSA不能诱导DSBS。结论1间接遗传毒物BAP能诱导ΓH2AX焦点的形成,并且有时间剂量依赖效应。2非遗传毒物AZA/CSA不能诱导ΓH2AX焦点形成。3ΓH2AX焦点形成与DSBS之间有着密切关系,可以用来准确地检测DSBS的发生。
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      上传时间:2019-03-28
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    • 简介:研究背景与意义二十世纪九十年代人类基因组计划HUMANGENOMEPROJEET,HGP的提出及完成,极大地促进和带动了一系列生物基因组计划的蓬勃发展。截止到目前为止,GENBANK已经登录了数千种生物的基因组序列,并且还有数百种生物的基因组测序正在进行之中。在登录的基因组数据中,有的完成了初步注释,有的仅仅是完成了测序工作。尽管测序工作进展神速,但基因功能研究明显滞后,这给科研工作者提出了新的课题。因此,基因功能研究成为了后基因组学或功能基因组学时代的艰巨任务之一。本室在前期工作中分离鉴定了3株铜绿假单胞菌噬菌体,分别命名为PAP1、PAP2和PAP3PSEUDOMONASAERUGINOSAPHAGE。目前,溶源性噬菌体PAP2和PAP3全基因组测序及基因初步注释工作已经完成,并提交到GENBANK。裂解性噬菌体PAP1基因组也已经完成了部分测序。根据分析,这三种噬菌体所预测的基因中大多数为功能未知基因。因而,展开对这些基因的分析及功能验证成为我们面临的重要任务。在功能基因研究中,我们首先把目标集中在与噬菌体裂解细菌有关的基因上。这是因为,噬菌体是以细菌为宿主的病毒,噬菌体在感染宿主菌时,必须穿过细菌的细胞壁肽聚糖层,或者将其核酸注入到宿主菌体内进行复制。噬菌体在完成复制、组装后,又必须破坏宿主肽聚糖层,释放子代噬菌体,进而感染新的细菌。因此,噬菌体完成其繁殖,必须“一进一出”两次穿越宿主菌的细胞壁屏障。与单链DNA/RNA噬菌体不同的是,双链DNA噬菌体感染宿主的结果,往往最终杀死宿主菌。因此,噬菌体在感染过程中必然产生一种能够破坏宿主细胞壁肽聚糖层的相关酶类。而细胞壁是细菌赖以生存的基础,能够破坏细胞壁的酶类也就有可能成为潜在的抗感染药物。根据文献报道,控制双链DNA噬菌体进出宿主细胞的物质是一种由噬菌体编码的蛋白,称作内溶素或者肽聚糖解聚酶ENDOLYSIN或者LYSIN,简写为ELYS。内溶素作为一种酶蛋白,可以破坏噬菌体宿主菌的细胞壁肽聚糖。因而,内溶素有可能成为某些致病细菌特别是耐药性致病菌的潜在的抗感染药物。另外,大部分噬菌体的内溶素由于缺少信号肽不能够穿透宿主细胞膜,通常需要噬菌体编码的一种穴蛋白HOLIN辅助才能够穿过宿主细胞膜,进入周间质进而作用于宿主细胞壁肽聚糖层。因此,对于噬菌体内溶素及穴蛋白进行广泛深入的研究不但有助于了解噬菌体与宿主的相互作用、揭示生命的多样性,而且将内溶素作为生物制剂,应用于噬菌体治疗PHAGETHERAPY也有重要的研究意义。材料与方法收集GENBANK中已经登录的全部铜绿假单胞菌双链DNA噬菌体基因组序列含我室提交的噬菌体PAP2和PAP3基因组序列及我室未提交的噬菌体PAP1部分基因组序列。首先,初步分析各基因组组成特点,并进行比较基因组分析其次,通过对所有基因组可能编码的ORF进行BLAST检索,从而推定所有可能的内溶素及穴蛋白基因再次,对发现的铜绿假单胞菌噬菌体内溶素及穴蛋白进行比较、归类、三级结构预测、系统发生进化分析及跨膜结构域预测最后,克隆、表达推定的铜绿假单胞菌噬菌体PAPL内溶素基因,纯化基因表达产物,分析这些表达产物对底物肽聚糖的降解活性及抑菌作用,通过实验证实推定的内溶素的生物学功能。结果与讨论1铜绿假单胞菌噬菌体基因组比较经过搜集整理,共有20种铜绿假单胞菌双链DNA噬菌体基因组序列。除10种铜绿假单胞菌噬菌体基因组已完成了初步注释外,其余铜绿假单胞菌噬菌体基因组仅仅是完成了测序工作,未作任何注释。通过对基因组序列比较分析,除这三对噬菌体外,其它铜绿假单胞菌噬菌体基因组序列相互之间相似性极低。这三对噬菌体分别是PA7与PA16、119X与PAP2、SD1M与PHHIKZ,其中噬菌体PA7与PA16基因组序列之间相似性达99%以上,噬菌体119X和PAP2基因组序列之间相似性为93%,噬菌体SD1M与PHIKZ基因组序列之间相似性为99%。这些相似性的序列有的表现为大片段完全相同,呈嵌合体状态有的表现为突变碱基呈点状分散,且基因组两端序列变化显著。这种结构模式表明,噬菌体基因组的进化与其它物种的进化类似,分为渐变式和爆发式。其中爆发式进化可以用模块进化理论MODULAREVOLUTION来解释基因或蛋白的进化并不是通过连续的一个个的核苷酸或者氨基酸的替换,而是通过装配已经存在的编码蛋白多肽的核苷酸区段完成的,而进化的结果则表现在噬菌体基因组呈镶嵌型结构,且基因组两端序列变化显著。2铜绿假单胞菌噬菌体内溶素基因的推定根据铜绿假单胞菌噬菌体在GENBANK登录的序列及基因注释,已有12种内溶素基因被发现与命名。而我们对20种铜绿假单胞菌噬菌体基因组重新分析,新发现8种内溶素基因。这8种噬菌体内溶素基因分别是噬菌体F10的ORF37273~37890、噬菌体的F8OPF24127~26709及ORF34978~35637、噬菌体M6的ORF13111~13932、噬菌体PALL的ORF21764~22279、噬菌体SD1M的ORF147382~148161及ORF190416~197138、噬菌体PAP1的ORF25043~25603。3铜绿假单胞菌噬菌体内溶素分类对20种噬菌体内溶素基因编码的氨基酸序列经过CLUSTALW多重序列比对后生成的进化树结果来看,铜绿假单胞菌噬菌体内溶素可以分为4类包括N乙酰胞壁酸酶类、葡萄糖苷酶类、转糖基酶类和未知功能类。新发现的8种噬菌体内溶素中,属于N乙酰胞壁酸酶类的内溶素只有1种,是噬菌体PALL的ORF21764~22279编码产物属于葡萄糖苷酶类的内溶素有2种,分别是噬菌体F8的ORF34978~35637和F10的ORF37273~37890编码的产物属于转糖基酶类的内溶素有4种,分别是噬菌体M6的ORF13111~13932、噬菌体F8的ORF24127~26706及噬菌体SD1M的ORF147382~148161及ORF190416~197138编码的产物均而噬菌体PAP1的ORF25043~25603编码的产物由于同时与肽链内切酶和酰氨酶在N端序列上有一定的相似性,目前尚不能归类,本文将之归为未知功能类。4铜绿假单胞菌噬菌体穴蛋白基因推定在20种噬菌体中,已有3种噬菌体编码穴蛋白的基因被注释。我们对20种噬菌体基因组重新分析,新发现了2种穴蛋白基因,分别是噬菌体F10的ORF36944~37276及噬菌体M6的ORF12887~13219。5种穴蛋白的基因序列及编码的氨基酸序列具有共同的基本特征编码穴蛋白的基因位于内溶素基因的上游通常含有至少两个疏水区和一段较短的连接序列蛋白质多肽链氨基酸残基个数在71~111之间。此外穴蛋白基因在噬菌体基因组内与内溶素基因均有多个碱基的重叠现象GENESOVERLAP。在其它未发现穴蛋白噬菌体的基因组序列中,均能发现一个或几个编码含有跨膜区结构的基因,这些含有跨膜区结构的基因是否是噬菌体穴蛋白的候选基因值得深入研究。5噬菌体PAP1内溶素基因ELY的克隆、表达与纯化本文选择铜绿假单胞菌噬菌体PAP1内溶素基因进行验证。通过对PCR反应体系和条件的优化,以噬菌体PAP1基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得噬菌体PAP1内溶素基因全长序列。将该基因构建到表达载体PQE31中,然后转化大肠埃希菌M15PREP4并诱导表达。在一定范围内随IPTG浓度的增加,重组蛋白表达率增加,至04~06MM时基本达到最高峰值,重组蛋白表达最佳诱导时间为6H,重组蛋白表达形式主要以可溶性状态存在。经过NINTA亲和柱层析、UNOSPHERES阳离子交换层析及分子筛脱盐后,获得了与预测分子量大小相符的单一条带的目标蛋白。6底物的提取与ELY6H重组融合蛋白酶活性检测7ELY6H重组融合蛋白的抑菌活性检测结论本研究通过对铜绿假单胞菌噬菌体内溶素的基因推定,共发现20种内溶素基因和6种穴蛋白基因,其中8种内溶素基因和2种穴蛋白基因为本研究新发现基因。推定的内溶素基因分属于4个类群转糖基酶类、N乙酰胞壁酸酶类、N乙酰葡萄糖苷酶类和功能未知类。选择一推定的噬菌体PAP1ELY基因进行克隆和表达,同时对表达的ELY6H重组融合蛋白进行了纯化,得到较纯的重组融合蛋白。对该重组融合蛋白对底物肽聚糖的降解活性检测及抑菌活性检测。结果表明,推定的噬菌体PAP1重组内溶素融合蛋白对铜绿假单胞菌细胞壁肽聚糖具有降解活性,并且对金黄色葡萄球菌活菌具有一定的抑菌活性。该研究从实验方面证实了推定的噬菌体PAP1内溶素基因的生物学功能。但该基因的工程菌表达产物在医学抗感染方面可能不具有直接应用意义。
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    • 简介:在生物医学超声理论和应用中,非线性现象的研究是近年来的一个热点和难点。非线性原理应用于超声成像可以获得更高的分辨率和对比度,从而得到高质量的超声图像,更清晰、更真实地反映成像对象,在实际应用中已经表现出显著的优势和诱人的前景。本文的研究遵循严密、可行和有效的原则,对非线性超声的原理与应用中所需解决的若干重点问题在理论推理、建模、数值计算和仿真等层面上进行了较为深入的探讨。取得了如下几个方面的研究成果1提出了一种基于FOURIERBESSEL级数的新方法,用于计算吸收媒质中非线性超声场的高次谐波分量,得到其级数形式的解析解,由此推导出吸收媒质中零阶BESSEL超声场、GAUSS聚焦超声场高次谐波的封闭解析解,进而对其声场特性尤其是近场特性进行了研究。2通过频域有限差分方法求解KZK方程,对吸收媒质中的零阶BESSEL超声场、GAUSS聚焦超声场进行计算,得到基波和高次谐波声场的数值解和仿真图,计算仿真结果验证了上述的理论结论。3对于高次谐波超声成像原理及模型进行了初步研究,提出了一个高次谐波成像计算仿真模型的框架。
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