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    • 简介:为了探讨细胞内部的基因表达调控、信息传导、物质代谢和能量转换过程在维系细胞的正常生物学行为中的作用,认识这些过程的非正常化如何导致细胞的非正常生物行为,人们不仅需要在分子水平上了解每个生化过程的内涵,而且还需要对细胞的形貌特征、物理学性质以及生理学信息进行全面的解析和诠释。利用微观测与微操控技术检测细胞在不同的生理和病理状态下的形貌特征和物理学特性,从中提取能够反映细胞内部生物反应和细胞状态的生物标志物信息,揭示细胞物理学参数与细胞生物学性状的关联性,我们可以通过研究生物大分子之间的相互作用来奠定前期工作基础。原子力显微镜ATOMICFORCEMICROSCOPE,AFM作为上个世纪80年代发明的一种获取物体表面纳米尺度信息的工具,为细胞与亚细胞结构及相互作用力的相关研究提供了强有力的技术手段。我们在本研究中主要利用AFM的技术特点,初步分析在大气和液体环境中对不同样品进行形态学上的扫描研究,对于AFM在液体条件中的操作条件进行优化对比。以此来考查在接近生理条件的缓冲溶液环境下,利用AFM来进行检测的优势,并优化在液相环境中对样品进行形貌扫描分析的操作条件。同时我们利用天然的云母片、醛基修饰的玻璃片等,对其进行形态特征进行研究,从而为了在研究生物样品时,可以选择更加适用于液体环境操作的AFM基底。在原子力显微镜研究生物样品的操作中,常用的基底材料一般采用化学修饰的基底或者云母片。云母片表面具有电荷,固定样品可以通过静电吸附作用来实现,而样品通过化学修饰到基底表面和云母片的静电吸附相比较,化学修饰可以增加基底表面结合的生物样品数量,同时共价键的作用力大于静电吸附,因此,我们需要参考进行下一步研究的目的和方案,来进行基底材料的选择。为后期工作利用AFM在接近生理的条件下研究生物大分子间的相互作用,形态活性,以及研究一些重要的生物学动态过程,提供科学的实验基础。另外,通过我们的研究发现,AFM在液体条件下可以消除表面毛细作用和静电力的干扰,因此在液体条件中所得的样品形貌图像更能反映出被测样品的真实状态。其次我们对AFM在气相和液相条件下的探针力距离曲线进行了分析比对,并以此测量生物大分子间的相互作用力。同时,我们对实验过程中的技术操作问题进行了改进,如减少温漂问题、弹性系数精准测量的方法、TRIGGERMODE的选择、XY方向大范围内闭环系统的选择、控制的多样性优化选择。在力距离曲线的测量中,由于采集的数据是通过AFM探针与基底弹性力的改变实时监测后得出的,为了解决数据信息量大的问题,我们选择聚类分析算法进行数据处理。对KMEANS算法的深入分析过程中发现选择适当的初始质心是KMEANS算法执行过程的关键步骤,因此我们对其进行改进,对数据分析的算法程序进行了改编,为解析生理条件下生物分子之间的相互作用力及生物反应过程中的动力学奠定初步的数据分析手段。原子力显微镜在液相条件下进行分子间作用力测量的操作中,我们针对实验过程中的技术操作及数据处理方面进行了优化,通过改变实验条件降低了温飘的影响,通过液体动力学模型对弹性系数进行精确测量,选用TRIGGERMODE模式来消除基底的影响,选取XY方向大范围内闭环系统来增大扫描范围,降低位置漂移,改变多个参量,达到多样化的控制同时对KMEANS算法进行了程序上的改进,这不同于实验条件的优化,而是针对控制程序进行的改良。第三,目前的实验手段在针对DNA分子双螺旋结构的研究中,还无法测量出与解链温度直接相关的杂交双链的成链亲和力,无法分辨出互补杂交双链的链间相互作用和链内相互作用,也就是双链DNA分子间的氢键结合力和碱基堆积力。为了能够在分子水平上全面系统地认识基因探针靶标核酸杂交双链的成键特性,认识基因探针对靶标核酸和非靶标核酸的辨异能力,我们利用原子力显微镜测量基因探针与靶标核酸相互结合时的力距离曲线,并由此导出最直接的物理参数氢键结合力和碱基堆积力。以自行设计的两种测量模式为基础,即解螺旋模式和拉伸模式分别测量DNA双链的成键特性,并计算出氢键结合力和碱基堆积力。有关DNA双螺旋结构中碱基堆积力的测量,这方面的工作还未见报道,多见的是氢键结合力的测量,我们设计模式中的拉伸模式即对应于碱基堆积力的测量。在形成DNA双螺旋的过程中,NACL浓度的影响是至关重要的,而文献中对于盐浓度的选择并无统一的标准同时,对于探针在基底表面的停留时间以及探针的加载速度也无准确的报道,这些不确定因素导致文献中,DNA双螺旋结构的氢键结合力测量数据的不一致性。因此,我们在进行双链DNA分子互补杂交双链的链间相互作用和链内相互作用的测量中,对上述条件进行了选择性优化,从而得出在目前条件下比较稳定的测量方法,并推导出双链DNA分子间的氢键结合力和碱基堆积力。这种PN级力的数据积累,对于研究病理条件下双链DNA分子间作用力的变化具有指导意义。在利用原子力显微镜进行双链DNA分子间的氢键结合力和碱基堆积力测量的时候,我们设计了含有10、14、20BP碱基对的寡核苷酸序列,形成GC及AT完全匹配的互补序列,通过对探针表面及醛基玻片基底分别进行化学修饰,并利用解螺旋模式和拉伸模式进行测量,选择NACL浓度为100MM,探针在基底表面停留时间为10S、探针加载速度20NM/S,作为最佳的测量环境,进而得出结论。在形成的DNA双螺旋结构中,GC间的氢键作用力为(20±02)PN,AT间的氢键作用力为(14±03)PN,DNA双螺旋间的碱基堆积力为(2±01)PN。通过以上实验,我们为进一步利用AFM在接近生理的条件下对生物样品之间相互作用的动态研究,以及适用于更广范围内的细胞物理特性的测量和相关操控提供了可靠的实验依据。
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      上传时间:2019-03-15
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    • 简介:研究背景CMYC及E2F1相关信号途径是决定细胞命运的核心机制之一,研究已证实HTERT是二者共同的下游靶基因,不同的是CMYC诱导HTERT表达,而E2F1则抑制HTERT的表达。由于E2F1也受CMYC正性调节,因此,我们推测在正常细胞中,E2F1可能对CMYCHTERT信号途径存在着负反馈调控,从而在一定程度上抑制了肿瘤发生的危险性。研究方法本项目拟针对上述假设,以人胚胎成纤维细胞为模型,采用基因转染、荧光素酶报告基因实验、CHIP、CHIPRECHIP等技术证实E2F1对CMYC诱导HTERT表达的负反馈调节作用。研究结果1CMYC活化对人胚胎成纤维细胞HTERT和E2F1表达及下游信号通路的影响以ADCMYC重组腺病毒感染人胚胎成纤维细胞,QRTPCR及WESTERNBLOT检测CMYC活化对E2F1和HTERTMRNA及蛋白表达水平的影响。结果显示,E2F1和HTERT的表达在CMYC激活的情况下均会出现增加,二者区别在于,前者的表达水平是在CMYC高度激活时才出现明显增加,而后者的表达水平则可在CMYC低度激活时就开始增加,而且CMYC激活的程度越高,HTERT的表达水平增加越多,其表达水平的增加与CMYC激活的程度是一致的。进一步,我们探讨了CMYC活化对E2F1和HTERT下游信号通路的影响,结果显示,在CMYC中低度时,端粒酶活性逐渐升高,而细胞凋亡的比率并没有明显改变在CMYC被高度激活的情况下,E2F1的蛋白表达水平出现明显升高,这也就能够增加细胞凋亡的比率。随后对E2F1加以抑制,我们发现在CMYC中低度激活时抑制E2F1表达,可致HTERT活化水平上升而在CMYC受到高度激活的同时对E2F1的表达加以抑制,则能够避免细胞凋亡,且细胞端粒酶的活性会出现有进一步的升高。以上这些结果显示E2F1对CMYC诱导HTERT表达是存在着负反馈调控作用的。2E2F1通过与HTERT启动子区域结合对CMYC诱导HTERT表达进行负反馈调控我们首先应用双荧光素酶报告基因实验证实,在人胚胎成纤维细胞中E2F1能够抑制HTERT基因表达,这个过程是可以通过E2F1与HTERT启动子的结合而得以实现的随后应用CHIP实验ANTIE2F1进一步验证E2F1可与HTERT启动子区域直接结合CHIPRECHIP实验ANTIE2F1和ANTICMYC则显示CMYC活化时同时与HTERT启动子区域结合的CMYC及E2F1蛋白水平增加,提示CMYC活化时,虽与HTERT启动子区域结合的CMYC蛋白水平增加,但由于抑制HTERT启动子活性的E2F1蛋白的结合水平也有增加,因而其转录并未开启,不会导致肿瘤发生。结论在正常细胞中,E2F1对CMYC诱导HTERT表达起到关键的负反馈调控作用,其对限制CMYCHTERT信号通路传导的致瘤作用具有重要意义。
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      上传时间:2019-03-15
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    • 简介:胞吞作用是一种囊泡介导的生物途径。细胞无论是从外界环境中吸收营养物质还是更新膜脂膜蛋白,都要依赖于胞吞作用。虽然已经明确了很多蛋白,例如RABGTP酶,在胞吞作用中起到了至关重要的作用,但是对于胞吞作用调控的详细机制研究的并不透彻。大部分研究都集中在胞吞的早期进程,对于胞吞的晚期进程,尤其是溶酶体相关进程还鲜有研究。溶酶体命运的研究不仅对揭示溶酶体相关动力学的调控机制,更对揭示胞吞作用的调控网络具有非常重要的意义。本文利用模式生物秀丽隐杆线虫CAENORHABDITISELEGANS对受体介导胞吞作用中的重要调控蛋白AGEF1的作用机制做了进一步研究,克服了AGEF1缺失后线虫表现为胚胎致死以及发育停滞不能用于深入研究的难题,利用胚胎后RNAI的方法,在腔胞胞吞作用研究模型中深入研究了AGEF1对胞吞途径的影响,揭示了AGEF1在胞吞途径中的新作用。在线虫中AGEF1调控卵母细胞对卵黄蛋白的吸收并通过其GEF活性,调控ARF1/3的活性,影响卵母细胞发育过程中CAVEOLIN1的形成。但迄今为止,AGEF1的亚细胞定位以及调控胞吞作用的详细机制并不清楚。我们应用含有大量标记的腔胞胞吞作用研究模型,发现AGEF1的缺失不仅严重影响腔胞对肌肉细胞分泌到假体腔中的可溶性蛋白GFP的吸收,而且腔胞中溶酶体的体积明显增大。进一步研究发现,溶酶体的酸性环境并未改变,水溶性物质胞吞后运输至溶酶体的途径正常,溶酶体的降解功能依然存在,揭示了AGEF1调控溶酶体的分离/融合过程,但并不调控溶酶体的功能。基因上位分析表明,AGEF1处于ARL8蛋白的上游调控内吞的早期过程,又处于ARL8的下游调控物质向溶酶体的运输以及溶酶体的融合/分离过程。细胞亚定位结果显示AGEF1定位于溶酶体膜上,表明AGEF1直接调控着溶酶体相关动力学。对内吞作用早期步骤标记的研究发现AGEF1在质膜附近调控CLATHRIN的分布直接调控腔胞对液相物质的内吞。并通过蛋白过表达以及分段蛋白过表达进一步证明了AGEF1通过结合不同的蛋白或者蛋白复合物调控腔胞内吞液相物质的能力以及腔胞溶酶体形态两个独立事件,且AGEF1并不依赖ARF1/3活性调控溶酶体的形态。总而言之,本论文发现了调控溶酶体融合/分离动力学过程的第一个GTP酶调控因子,对进一步全面深入了解溶酶体相关调控的详细机制以及胞吞作用的整合调控网络具有重要的推动作用。此外AGEF1在其他组织器官中的功能研究发现,AGEF1在神经系统中通过调节CLATHRIN的分布调控神经系统的活性。行为学分析发现AGEF1缺失后,线虫的爬行速率变慢,泳动速率却变快,揭示了这两种运动行为很可能是由不同的神经环路所控制,为研究CLATHRIN介导的胞吞作用在神经活动中的功能提供了良好的模型。
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      上传时间:2019-03-14
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    • 简介:细胞内钙离子浓度的快速变化是一种最为常见的细胞信号传递方式,与细胞分泌、基因表达、肌肉收缩等多种生命活动密切相关。胞内钙库操纵的钙离子内流STOREOPERATEDCA2ENTRY,SOCE是细胞摄取外源钙离子主要途径之一,SOCE主要由细胞内的钙库一内质网或肌浆网内的钙离子浓度的下降所激活。整个过程需要两个蛋白质家族的参与,一种是位于细胞质膜上的钙离子释放激活的钙离子通道CA2RELEASEACTIVATEDCA2CHANNEL,CRAC,现已确定这类通道由ORAI家族的三个蛋白组成;另一种是位于内质网或肌浆网膜上的一次跨膜蛋白STIMSSTROMALINTERACTIONMOLECULES家族。作为唯一一个既能作为细胞钙库浓度的感受器又能激活CRAC的蛋白家族,STIMS对于SOCE的调控起着极其关键的作用。目前,STIMS家族中的STIM1和STIM2分子位于内质网内的N端EFSAM结构域结合钙离子的三维结构已通过核磁共振的方法得以解析。但是位于细胞质内的C端部分的结构尚无报道。虽然通过各种细胞生物学和细胞电生理学实验,使得CRAC的调控机制研究取得了诸多进展,但由于缺少结构模型,使得CRAC激活的分子机制研究受到了很大的限制。本研究利用X射线晶体学方法解析了人源STIM1的SOAR结构域HSSOAR,和线虫来源的整个COILEDCOIL区CAENORHABDITISELEGANSSTIM1COILEDCOILREGION,CESTIM1CCR。根据结构分析的结果,利用细胞生物学和生理学手段,对CRAC激活的分子机制进行了系统性的研究和分析。HSSOAR分子形成的“V”型的二聚体为激活ORAI1通道所必需。根据结构分析设计的干扰HSSOAR二聚体形成的突变可以使得HSSOAR和全长HSSTIM1完全失去对HSORAI1的激活能力。HSSOAR二聚体“V”字型的两个顶端均存在一个正电荷聚集区,破坏这个正电荷区的突变体同样会失去激活HSORAI1通道的能力。CESTIMLCCR片段的结构包含整个SOAR结构域以及靠近SOARN端的一段小螺旋IH,这段螺旋与SOAR结构域存在多种相互作用。通过对IH的敲除突变发现,当STIM1分子失去IH之后,会在细胞钙库内钙离子充足的情况下仍然组成性的激活ORAI1通道,提示了IH对于细胞静息状态下维持STIM1的自抑制状态起关键作用。通过对于STIM1两个片段的结构分析和功能研究,结合关于CRAC现有的研究结果,我们提出了STIM1激活CRAC的分子模型在细胞静息状态STIM1分子N端以单体形式存在,整个分子通过SOAR形成二聚体,IH与SOAR结合使整个分子处于自抑制状态;钙库排空时,STIM1分子N端发生聚集,导致C端发生变构,IH释放SOAR,STIM1以二聚体为基本单位激活ORAI1通道,同时通过N端的聚集招募更多STIM1与ORAI1发生作用,使得钙离子内流速度达到最大。本研究首次解析了STIM1分子C端胞质区SOAR结构域和CCR结构域的三维结构,并以结构分析为基础,通过细胞生物学和生理学的实验手段,揭示了STIM1激活CRAC的分子机理,对于了解CRAC调控机制具有重大意义。
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      上传时间:2019-03-14
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    • 简介:能量是生物各种生命活动的动力。ATP是生物体各种生命活动所需能量的直接来源,线粒体普遍存在于真核细胞的细胞质中,它是能量ATP的供给中心,是对各种损伤最为敏感的细胞器之一。ATP酶是用来水解ATP为生命活动提供能量的酶。生物体内的ATP和ATP酶在新陈代谢过程中具有极为重要的作用。目前国内外对邻苯二甲酸二异辛酯毒性的研究已有许多报道,且研究已经深入到了分子水平,但是关于DEHP对动物各个脏器的ATP酶以及线粒体的ATP酶活性的影响的研究还未见报道;此论文的研究对邻苯二甲酸二异辛酯生物学毒性的研究具有重要意义。本实验选用SPF级昆明纯系雄性小鼠的肝脏、心脏、肾脏、大脑和睾丸为材料,探讨了DEHP体内染毒对小鼠各个脏器ATP酶和各个脏器线粒体ATP酶活性的影响以及可能的作用机制。实验根据ATP酶分解ATP生成ADP及无机磷,通过测定无机磷的量来确定ATP酶活性高低。实验结果表明,随着DEHP染毒剂量的增大,在肝脏、大脑、睾丸组织中,NAKATP酶CAMGATP酶的活性呈先下降后上升趋势,肝脏在200MGKGD时酶活性最低,大脑、睾丸在100MGKGD时酶活性最低。但是在心脏、肾脏组织中,NAKATP酶和CAMGATP酶的活性呈先上升后下降趋势;NAKATP酶在200MGKGD浓度、CAMGATP酶在300MGKGD浓度时,酶活性最高。在肝脏和心脏的线粒体中,NAKATP酶和CAMGATP酶的活性,随着DEHP染毒剂量的增大呈下降趋势,在肝脏线粒体中,300MGKGD浓度组NAKATP酶的活性与对照组比有显著的差异性。DEHP对同一器官的两种ATP酶即NAKATP酶和CAMGATP酶的活性的影响趋势是一致的。这提示DEHP对这两种酶的活性的影响机制可能具有相似性。但是,DEHP对不同器官中的同一种酶的活性的影响趋势是不相同的,也就是说DEHP对各个脏器的ATP酶活性的影响具有器官差异性。因此,DEHP对小鼠脏器细胞ATP酶的活性是有影响的,对小鼠脏器细胞线粒体ATP酶的是有影响的,是导致机体各个脏器损伤和功能下降的重要因素之一,是导致机体慢性毒性的重要因素之一。
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      上传时间:2019-03-13
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    • 简介:细胞体系的检测与食品安全检测、疾病诊断、环境监测等领域息息相关,因此,快速、准确地检测细胞体系具有举足轻重的意义。目前,细胞体系检测的常用方法主要包括荧光分析法、酶联免疫分析法、生物传感器、流式细胞术等。这些方法在缩短检测时间、提高检测灵敏度和准确性等方面作出了重要贡献。然而,在将这些方法用于细胞体系检测时,通常还存在着样品需要预富集、信号强度受限制等缺陷。因此,待测样品在同步检测过程中实现有效分离与富集以及增强检测过程中获取信号的强度对于建立快速、灵敏的细胞体系检测新技术十分必要。近年来,具有高荧光强度和较好光稳定性的荧光纳米粒颗粒已被广泛应用于生物医学分析领域,相对于传统的标记方法,功能化荧光纳米颗粒标记技术能大大提高检测灵敏度和光稳定性同时,介电泳理论和微电加工技术的快速发展,为样品中少量细胞作为对象的超灵敏检测提供了新的契机。本论文瞄准细胞体系的快速、灵敏检测这一重要研究方向,在对细胞体系主要是病原菌细胞和肿瘤细胞检测方法进行简要综述的基础上,以荧光纳米颗粒标记、核酸适体探针识别特性与介电泳富集技术用于大肠杆菌O157H7、CEM细胞等重要细胞的快速、灵敏检测为主线,主要开展了以下几个方面的研究工作1、生物修饰的荧光二氧化硅纳米颗粒对大肠杆菌O157H7介电性质的影响设计并利用抛物线电极研究了生物修饰的荧光二氧化硅纳米颗粒结合到大肠杆菌O157H7表面后对大肠杆菌O157H7介电性质所产生的影响。通过考察50KHZ100MHZ的频率范围内大肠杆菌O157H7和表面结合了生物修饰的二氧化硅纳米颗粒后的大肠杆菌O157H7的介电泳行为,发现大肠杆菌O157H7在50KHZ80MHZ频率范围内表现为正介电泳行为,在90MHZ100MHZ频率范围内表现为负介电泳行为结合了生物修饰的二氧化硅纳米颗粒后的大肠杆菌0157H7在50KHZ60MHZ频率范围内表现为正介电泳行为,在70MHZ100MHZ频率范围内表现为负介电泳行为。研究结果表明结合生物修饰的荧光二氧化硅纳米颗粒后,大肠杆菌O157H7的正负介电泳的临界频率从90MHZ变成70MHZ,生物修饰的纳米颗粒结合在大肠杆菌O157H7表面后对大肠杆菌O157H7的介电性质产生了一定影响。该研究工作为用介电泳富集技术快速、灵敏检测大肠杆菌O157H7细胞打下了实验基础。2、基于介电泳富集技术和荧光纳米颗粒信号增强的微流控大肠杆菌O157H7检测研究在研究生物修饰的荧光二氧化硅纳米颗粒对大肠杆菌O157H7介电性质的影响基础上,提出了一种结合荧光纳米颗粒标记和介电泳在线富集技术的快速、灵敏、方便的微流控检测病原菌新方法。以大肠杆菌O157H7为检测对象,通过采用具有信号增强作用的包裹钌吡啶荧光染料的羧基化二氧化硅纳米颗粒修饰识别大肠杆菌O157H7的特异性抗体,实现对大肠杆菌O157H7的选择性结合与识别,在此基础上,在特定频率的交流电场下,利用设计的微流控芯片对标记生物修饰的荧光纳米颗粒的大肠杆菌O157H7进行定向富集,再通过测量富集区域荧光信号的强度,实现对大肠杆菌O157H7进行定量检测。由于未与大肠杆菌O157H7结合的纳米颗粒不会表现正介电泳行为,在微流控芯片中直接被冲走。因此,这种新方法成功地将需要去除多余荧光纳米颗粒的分离与洗涤过程整合到检测过程中。该方法对大肠杆菌O157H7检测的线性范围为42X102~42106CFU/ML,对去离子水中大肠杆菌O157H7的检测限为64CFU/ML。同时,我们在人工污染的实际水样品中能精确检测到420CFU/ML的大肠杆菌O157H7。该方法的整个检测过程可以在80MIN内完成,为实现在食物、水中和环境样品快速、灵敏、低成本地检测病原菌的方法提供了契机。3、基于介电泳富集技术和APTAMER识别特性的CEM细胞检测研究将核酸适体探针APTAMER对肿瘤细胞的特异性识别与结合作用和介电泳富集技术相结合,发展了一种新型的基于核酸适体探针识别特性与介电泳富集技术的CEM细胞检测方法。通过采用FAMSGC8C核酸适体探针对目标CEM细胞进行特异性识别后,将其加入到设计好的电极芯片上,用波形/函数发生器提供一定的电压与频率,通过介电泳力将FAMSGC8C识别的CEM细胞富集在检测区域,采用荧光显微镜对聚集的CEM细胞进行荧光成像检测。结果表明,该方法可以成功应用于在缓冲液体系中检测CEM细胞,检测线性范围是8110412106CELLS/ML,在10ΜL5%蔗糖溶液的缓冲液中最低可检测到1200个CEM细胞。整个检测步骤包括样品预处理可在4H内完成,有望应用于临床实际标本中肿瘤细胞的检测。
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      上传时间:2019-03-13
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    • 简介:表面等离激元SPPS是由电磁场辐射激发引起金属表面自由电子在金属/介质表面的固有振动,它是光和纳米金属完美结合的产物。由于对周围环境折射率变化非常敏感,在光学传感器的潜在应用受到广大国内外学者追捧。SPPS共振技术由于其独特的优点,在研究生物分子相互作用、生物分子检测及成像等方面展现了它独有的魅力。本论文基于SPPS与还原性细胞色素CYTOCHROMEC,CYTC分子之间的等离子能量转移PLASMONRESONANCEENERGYTRANSFER,PRET的物理机制,采用时域有限差分方法,研究了还原性CYTC分子对周期金属光栅及金属狭缝的光透射性质的影响。我们的研究工作可以为设计生物探测器件提供理论指导,在超灵敏生物传感器和进行活体生物分子成像方面具有很大的潜在应用。具体的研究内容如下1、利用时域有限差分法,研究了含CYTC分子的一维金属光栅结构的电磁波透射谱特性。研究发现这种周期结构产生的表面等离子激元和局域表面等离子激元混合模式,会对吸附在其上面的CYTC分子有着明显的相互耦合。表面等离激元的能量会直接转移给CYTC分子,导致了其透射峰上出现霹雳现象,我们的研究加强了对PRET现象的理解,研究结果在分子识别和检测方面有潜在的应用。同时,我们分析了该结构参量对其透射谱的影响。发现结构周期、狭缝宽度、狭缝长度以及分子层数可控制透射谱线的形状,但是透射峰凹陷的位置不会改变。这说明透射谱中的劈裂谷波长由CYTC分子本身性质所决定。由于结构参数的不同,导致透射谱存在着很大的差异。在实际应用中,结构参数的优化对设计器件成功具有指导意义。2、我们讨论了基于局域表面等离激元单缝金结构的透射谱特性。通过和周期结构比较,发现在其透射谱上也会出现同样的物理现象,在对应CYTC分子吸收峰的位置透射谱上出现透射谷,这也暗示狭缝的局域表面等离激元和CYTC分子间存在能量转移机理。同样,我们研究了狭缝结构参量对其透射谱的影响,发现尽管其透射率较低,但相对透射效果明显。研究证实了基于PRET的局域表面等离子激元共振技术检测生物分子的可行性。
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      上传时间:2019-03-13
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    • 简介:细胞作为生命有机体构成和生命活动的基本组成单位,其形态结构复杂多样,功能多种多样,能准确而及时地反映生物体的各项基能情况。细胞的识别和分析在多个科学领域受到越来越多的关注,尤其在生物医学方面,研究疾病的发病机制,诊断疾病以及评估治疗效果,都依赖于对生物细胞的检测和研究。近年来,多种数字定量相位显微技术发展迅速,因其快速、可定量、非侵入等巨大优势在生物细胞形态测量方面得到了广泛的应用。光路的稳定性、精确性和光信息提取的呈现方式是影响光学生物细胞检测的主要原因之一。因此、对生物细胞相位成像技术改进和提高,以获得高稳定性、高精确性的研究是一项十分有意义的工作。本文对细胞相位显微检测技术的几种典型光路进行特征分析,研究其光路结构和主要使用的光学器件,发现好的实验结果并不一定需要好的实验平台和高成本的光学器件。基于马赫曾德尔干涉光路应用的普遍性,对传统马赫曾德尔光路下的相位显微成像进行了动态仿真实验,并且设计搭建了两种结构不尽相同的马赫曾德尔相位显微光路,开展了比较性研究,仿真结果和实验结果均表明了简单的实验结构获得的结果并不一定差。本文依据相位显微成像技术对简单性、低成本、高稳定性的需求,应用典型相位显微光路的基础结合几何光学的知识,设计了一款免显微物镜共光路的相位显微方法。该方法只需简单的光学器件,如透镜、反射镜,实验操作简单。并采用了共光路形式,避免了物参异路对实验结果产生的噪声等误差。根据所设计的免显微物镜共光路相位显微方法,搭建验证性实验光路,得到干涉图。与基于马赫曾德尔光路实验获得的实验结果比较,验证了本方法的可行性和高效性。实验结果在生物细胞形态结构的重建方面具有很好的应用价值,为后期更加深入的研究提供了探究思路。
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      上传时间:2019-03-13
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      上传时间:2019-03-13
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    • 简介:诱导性多能干细胞IPSCS是利用特异的诱导因子组合,如重编程因子组合或结合某些小分子化合物等将成熟的体细胞去分化为类似于胚胎干细胞的一种多潜能细胞。这些细胞具有胚胎干细胞的特征,并能分化为三种胚层细胞。有关IPSCS的研究极大地促进了细胞的分化调控、再生医学、细胞发育等基础研究,并有极高的临床应用前景。本文利用慢病毒介导的基因转染技术将重编程因子组合SOX2、OCT4、CMYC和KLF4导入原代培养的大鼠肝细胞,对其进行诱导去分化。肝细胞在含四种重编程因子的重组慢病毒感染7天后,其形态开始发生改变。将其转移到饲养层细胞MEFS上培养11天后,部分细胞聚集在一起,呈致密克隆状生长,边界清晰且致密整齐,形成与大鼠胚胎干细胞相似的克隆。这些克隆细胞较小、增殖迅速,且在高倍镜下观察到细胞核较大,核质比率较高。从克隆形态初步判断为大鼠IPSCS克隆,碱性磷酸酶染色结果显示,这些细胞克隆表达了高水平的碱性磷酸酶。采用逆转录PCRRTPCR分别分析诱导的细胞克隆、大鼠原代培养肝细胞和大鼠45天胚胎中的基因表达状况。结果显示外源重编程因子OCT4、SOX2、CMYC和KLF4仅在诱导的细胞克隆中表达;大鼠胚胎干细胞标志基因SOX2、OCT4、NANOG、FGF4、LIN28和NCAM在诱导的细胞克隆和45天大鼠胚胎中均有表达。进一步的免疫荧光染色检测结果显示,上述诱导的细胞克隆表达了大鼠胚胎干细胞的标志蛋白SSEA1和NANOG。综上结果表明,本实验成功地将大鼠原代培养的肝细胞诱导去分化成了大鼠肝细胞来源的IPSCS。
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      上传时间:2019-03-13
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    • 简介:目的酵母双杂交技术证实PHB1与CLIC1在酵母中的相互作用;构建带FLAG标签的PHB1真核表达载体和带GFP标签的CLIC1真核表达载体;将其共转染至COS7细胞,观察其在哺乳细胞株内的共定位的具体情况;转染至HEK293T细胞,进行免疫共沉淀,检测在哺乳动物细胞内PHB1蛋白与CLIC1蛋白能否相互结合。方法以含人PHB1全长CDNA序列的质粒PLENTI6PHB1为模板,用PCR方法扩增PHB1全长序列,双酶切后回收目的片段,连接到载体PGADT7上,构建酵母表达载体PGADT7PHB1;双酶切PGADT7PHB1回收目的片段,连接到载体PGBKT7上,构建载体PGBKT7PHB1;以PACT2CLIC1为模板,用PCR方法扩增CLIC1全长序列,BAMHⅠ单酶切回收目的片段,连接到PGBKT7上,构建酵母表达载体PGBKT7CLIC1和PGADT7CLIC1。把测序正确的酵母表达载体分组转化至酵母菌AH109,在SD/LEU/TRP/HIS/+3AT/XΑGAL盘上筛选蓝色的克隆。呈蓝色的克隆是ΑGAL活性为阳性的克隆,再通过滤膜印迹实验测定B半乳糖苷酶活性进一步验证它们的相互作用情况。用PCR方法扩增PHB1全长序列构建真核表达质粒PCDNA3FLAGPHB1,后转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其在细胞的定位;将构建正确的质粒PCDNA3FLAGPHB1和PCDGFPCLIC1共同转染至COS7细胞,通过免疫荧光显微镜观察PHB1蛋白和CLIC1蛋白在细胞内的共定位情况;将质粒PCDNA3FLAGPHB1和PCDGFPCLIC1共同转染至HEK293T细胞,提取细胞裂解液,进行免疫共沉淀,后通过WESTERNBLOT检测在哺乳动物细胞内PHB1蛋白与CLIC1蛋白能否结合。结果经酶切和测序鉴定,各组质粒均构建正确。营养筛选及Α,B半乳糖苷酶活性的测定均表明PHB1和CLIC1能相互作用;PCDNA3FLAGPHB1和PCDGFPCLIC1转染至COS7细胞中,免疫荧光显微镜观察PHB1和CLIC1共定位于细胞核周围区域;免疫共沉淀和WESTERNBLOT检测证明PHB1蛋白和CLIC1蛋白在HEK293T细胞中相互结合。结论酵母双杂交系统3初步证实PHB1和CLIC1之间存在相互作用;免疫荧光显微镜观察PCDNA3FLAGPHB1和PCDGFPCLIC1在COS7细胞中存在共定位,主要聚集于胞质中;免疫共沉淀和WESTERNBLOT检测进一步证明PHB1蛋白和CLIC1蛋白在哺乳动物细胞中相互结合。
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      上传时间:2019-03-13
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    • 简介:学校代码10285学号20134221107硕士学位论文硕士学位论文(学术学位学术学位)论文题目CBLB/CCBL对CD8DC发育的抑制作用及机制研究题目英文翻译THEFUNCTIONANDMECHANISMOFCBLB/CCBLININHIBITINGTHEDEVELOPMENTOFCD8DC研究生姓名闫韵秋指导教师姓名张进平专业名称免疫学研究方向淋巴细胞发育所在院系生物医学研究院论文提交日期2016年4月
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      上传时间:2019-08-16
      页数: 93
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    • 简介:神经干细胞的发现为中枢神经系统损伤和退行性疾病的治疗带来了希望。因此,对神经干细胞在体外培养条件下的增殖和分化研究具有重要意义。目前,常用于诱导神经干细胞体外定向分化的方法是制作带有特定模式的微环境。本文的研究旨在通过显微注射系统将特定浓度的溶液按一定模式定量地涂覆到基底表面,实现基底表面微环境的制作,并诱导神经干细胞体外定向分化。在基底表面微环境的制作中,本文提出了微涂覆条纹模式控制方法,定量的控制了微涂覆条纹的宽度,并对神经干细胞体外定向分化模式实现了控制。首先,本文通过实验,对影响微涂覆条纹稳定控制的因素进行了深入研究,给出了微涂覆条纹稳定控制时,微涂覆溶液的浓度、微涂覆针尖的移动速度、微涂覆针尖压入基底的位姿以及微涂覆条纹涂覆的方向这四个因素的适用范围。为后续定量的控制微涂覆条纹宽度方法的研究奠定了基础。其次,本文基于JKR接触理论,进行了空针压痕建模;在空针压痕模型的基础上,利用实验中发现的条纹涂覆宽度与空针压痕成比例关系这一规律,对液体扩散现象建模;结合空针压痕模型与液体扩散模型,建立了微涂覆条纹宽度控制模型,实现了定量控制微涂覆条纹宽度的目的。最后,本文通过神经干细胞体外培养实验展示了微涂覆条纹模式控制方法在生物领域的应用,并验证了通过控制微涂覆条纹宽度进而控制神经干细胞分化模式方法的有效性,体现了本文研究方法的应用价值。在神经干细胞分化模式有效控制的基础上,对神经干细胞培养结果进行了统计分析,得到了神经干细胞生长发育过程中的规律性结果。
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      上传时间:2019-03-13
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    • 简介:背景JNK信号通路对从细胞的增殖和分化到细胞的程序性死亡在内的广泛的细胞活动调节,都起到了非常关键的作用,同样的,在一些疾病的发生和发展中也扮演了非常重要的角色,这其中包括糖尿病和癌症。JNK在物理应力,细胞因子,T细胞共刺激和生长因子等各种胞外刺激的作用下做出应答,通过MAP激酶模式下一系列蛋白的顺序性磷酸化得到激活。JNK有两个普遍表达的同源异构体,JNK1和JNK2。有报道说明JNK1,而非JNK2,是实现TNFΑ诱导的JNK激活,CJUN蛋白表达和细胞凋亡所必需的。作为一个重要的转录因子,MIZ1通过激活或抑制转录参与调节了DNA损伤应答,细胞周期停滞,细胞增值,分化和凋亡的过程。除了转录因子的功能,MIZ1还可以作为信号或通路特异性的调节子SMOR特异性地调节TNFΑ诱导地JNK1激活和细胞死亡。在TNFΑ的刺激下,含有HECT结构域的E3泛素连接酶MULE泛素化MIZ1,释放MIZ1对JNK1激活的阻遏作用,进而引起JNK信号通路的激活和细胞凋亡。目的尽管MULE控制一些关键分子的水平,调节相关的信号转导的功能已经得到了共识,但是MULE仍是一个没有得到透彻理解的新的蛋白。它巨大的结构暗示MULE本身仍隐藏了许多的可能性。在高度动态的信号网络中,MULE又是怎样受到调节的机制仍不清楚。这篇论文尝试证明,不仅MULE可以调节TNFΑ诱导的JNK激活和细胞凋亡,JNK的激活对MULE也有反馈效应,调节MULE的表达。方法首先,用免疫印迹法检测MULE,MIZL,JNK,P38,和CJUN在野生型WT,JNK1/ANDJNK2/细胞中蛋白的表达情况。我们把JNK1重新引进JNK1/细胞,在HEK293细胞中过表达JNK1,或用SIRNA降低JNK1的表达,用免疫印迹法分别检测MULE的表达水平。采用半定量RTPCR检测MULE在WT,JNK1/ANDJNK2/细胞中MRNA的表达水平。我们用USCS得到了预测的MULE启动子序列,把它亚克隆到没有启动子的荧光素酶报告基因质粒PGL2BASIC中,命名为MPLUC。在共转录RSVCJUN或者空载体,以及TNFΑ分别诱导WT,JNK1/ANDJNK2/的情况下,用荧光素酶活性分析法检测MULE启动子的活性。最后,我们用TFSEARCH程序13版本鉴别得到了MULE启动子上的AP1结合位点。在不受TNFΑ刺激和在TNFΑ刺激的情况下,采用染色质免疫沉淀分析法CHIP分别检测体内CJUN蛋白和MULE启动子上AP1位点的结合情况。结果免疫印迹法分析显示MULE的蛋白水平在。JNK1/细胞中大大减少,其CJUN蛋白的表达量也少于JNK2/和WT细胞。把JNK1重新引进JNK1/细胞,MULE的蛋白表达得到了部分修复。通过转染HAJNK1质粒在HEK293细胞中过表达JNK1,进一步增加了MULE蛋白的表达。通过SIRNA基因沉没降低JNK1的表达,大大减少了MULE的表达水平。半定量RTPCR检测显示,MULE的MRNA在WT,JNK1/和JNK2/细胞中的表达情况和其蛋白的表达情况一致。共转染RSVCJUN促进了MULE启动子的活性,而且其活性的增强趋势与CJUN表达的增强趋势相一致。TNFΑ刺激下,JNK2/细胞中MPLUC的活性大大增强,其程度高于在WT细胞中。而MPLUC的报告基因表达情况在TNFΑ后没有明显的改变。染色质免疫沉淀分析法显示,在未受刺激的情况下,WT细胞中CJUN已经结合在MULE启动子上的AP1位点,TNFΑ诱导JNK激活进一步促进CJUN和MULE启动子上AP1位点的结合。结论转录因子CJUN,是AP1家族的主要一员,它是JNK激活的重要下游效应子。被JNK特异性磷酸化激活后,CJUN和MULE启动子上的AP1位点结合,进一步促进MULE的转录。在这里,JNK对MULE的调节起到了一个正反馈的作用,通过CJUN蛋白在转录水平上调节MULE的表达。
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    • 简介:癌症是导致人类疾病死亡的主要原因之一。侵袭和转移是恶性肿瘤细胞的基本生物学特征,也是导致癌症患者死亡的主要原因。关于肿瘤细胞的侵袭和转移的研究一直是生命科学的研究热点,但长期以来其分子机制一直未得到完全阐明。为了寻找参与肿瘤发生、发展及转移的相关基因,本课题组对细胞来源相同但转移能力不同的两个人肺腺癌细胞系的基因表达差异进行分析时,获得了一个存在差异表达的CDNA片段。随后,采用生物信息学方法、RACERAPIDAMPLIFICATIONOFCDNAEND技术和DNA测序相结合的方法获得了该基因的MRNA全序列。BLASTN比对结果显示,该基因与HOMOSAPIENSCHROMOSOME1ORF109C1ORF109,序列号为NM_0178501同源,是一个功能未知的新基因。为了进一步研究C1ORF109基因的表达及生物学功能,在本文中将对该基因的转录调控、亚细胞定位、表达模式、及其在细胞增殖和细胞周期调控过程中的作用进行初步的研究。此外,还对其潜在的相互作用分子进行了筛选和验证。本研究采用双荧光素酶活性分析、凝胶电泳迁移率分析EMSA和染色质免疫沉淀CHIP分析等技术,对C1ORF109基因启动子区的顺式作用元件和反式作用因子进行了确认。结果发现,在C1ORF109基因的启动子区域内存在两个关键的顺式调控元件,CAATBOX和TATABOX。同时,实验结果还表明,C1ORF109基因的5′非翻译区可以特异地结合转录因子SP1,转录因子SP1参与C1ORF109基因的转录调控过程。为分析C1ORF109基因产物的生物学功能,本研究首先对蛋白C1ORF109的基本理化性质、亲疏水性、高级结构、功能结构域和磷酸化位点进行了生物信息学预测,提示C1ORF109可能是蛋白激酶CK2的底物,其第104、134、182位丝氨酸残基是其潜在的磷酸化位点。在C1ORF109蛋白定位分析中,通过免疫荧光和细胞组分分离等实验证实,C1ORF109主要定位于细胞核和细胞质。实验结果亦证实了C1ORF109是一个磷酸化蛋白质,并可在体外被CK2激酶特异的磷酸化,CK2激酶对C1ORF109的磷酸化不影响后者在细胞内的定位。为明确C1ORF109基因与肿瘤的关系,本研究还采用免疫印迹和实时定量PCR等方法对肝癌临床病例组织、乳腺癌细胞系、肺癌细胞系、黑色素瘤细胞系中C1ORF109基因的表达情况进行了分析。结果显示,肝癌组织C1ORF109基因MRNA表达增高,蛋白表达与MRNA表达一致。而且C1ORF109蛋白在多种肿瘤细胞系中均呈现表达增高的趋势。结合C1ORF109在肿瘤中表达上调的特点和CK2激酶在细胞增殖调控中的作用,我们进一步分析了C1ORF109基因在细胞增殖、细胞周期调控和肿瘤细胞转移过程中的作用。PCDNA31C1ORF109重组体稳定转染乳腺癌HS578T细胞,在集落形成实验中,过表达外源C1ORF109重组蛋白的细胞所形成的集落数明显增多P利用原核表达的GSTC1ORF109重组蛋白对HELA细胞的全细胞裂解液进行GSTPULLDOWN分析,差异条带经液相色谱串联质谱LCMS/MS分析后得到多种与C1ORF109蛋白有潜在相互作用的蛋白因子,并采用免疫荧光共定位和免疫共沉淀的方法证实了C1ORF109与MARVELD1蛋白之间的相互作用,二者间的相互作用亦受到C1ORF109磷酸化状态的影响。综上所述,本研究证实了新基因C1ORF109编码一个CK2激酶的底物,并参与细胞增殖和细胞周期的调控,体外实验结果也证实了该基因能够影响肿瘤细胞的侵袭能力。
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