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    • 简介:学校代号10532学号B1211S018密级湖南大学博士学位论文基于滚环DNA扩增和纳米材料的生物传感分析方法研究学位申请人姓名孔登姐导师姓名及职称楚霞教握培养单位丝堂丝王堂院专业名称盆扳丝堂论文提交日期2Q鱼生Q三旦论文答辩日期2Q鱼生Q§目答辩委员会主席昱篷蕉熬援湖南大学学位论文原创性声明本人郑重声明所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名讪首娟日期2。/占年/月舌日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密O,在年解密后适用本授权书。2、不保密毗请在以上相应方框内打“√”作者签名导师签名劢许娟塑儒日期加∥年G月6日13期即膨年彳月占日
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      上传时间:2019-08-16
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    • 简介:木质纤维素是地球上分布最广、蕴藏量最丰富的可再生资源,实现木质纤维素的高效转化够解决人类面临的能源和资源问题,实现人类的可持续发展。在木质纤维素的转化过程中需要多种糖苷水解酶的协同作用,糖苷水解酶GH5家族被称为“纤维素酶家族A”,在数量上是非常庞大的糖苷水解酶家族。基于序列一致性,GH5家族被分为51个亚家族。随着蛋白质组学和结构生物信息学的发展,基于序列和结构信息的活性架构序列谱对纤维素酶进行理性改造,有助于探究纤维素酶与底物之间的结合、催化断键和产物释放机制,阐明其中的共性规律,为实现纤维素的高效转化奠定坚实的理论和应用基础。本文以糖苷水解酶GH52亚家族的CHCEL5A为研究对象,对其活性架构中起关键作用的完全保守氨基酸和相对保守的芳香族氨基酸进行定点突变和理化性质的分析,寻找纤维素酶降解底物时的规律。本文的研究内容及主要结果如下1、对GH52亚家族的纤维素酶进行了生物信息学分析,找到完全保守氨基酸的N165、Y227和相对保守芳香族氨基酸W61、Y203。对整个GH52亚家族有结构的酶分子进行了生理生化性质的统计,显示GH52亚家族的酶分子具有较宽的温度和PH的适应范围。该家族的拓扑结构为TM桶,即(Β/Α)8桶结构,活性架构具有较强的负电性,嗜热酶的带电性基本强于中温酶和低温酶的带电性。根据活性架构序列谱以及CHCEL5A与底物距离为5A的原则,找到完全保守氨基酸N165、Y227和相对保守芳香族氨基酸W61、Y203进行研究,该项研究为后续的实验工作奠定了基础。2、对CHCEL5A活性架构中保守氨基酸进行了突变和功能分析,发现保守氨基酸的突变能够改变酶分子的最小结合糖单元。通过糖苷水解酶GH5家族的活性架构序列谱中的N165和Y227,都位于1位亚位点,推测对于维持酶活力具有非常重要的作用,因此通过定点突变和大肠杆菌异源表达的方法进行N165A和Y227A的功能分析。N165A和Y227A突变体的CMC酶活均降低90%以上,说明完全保守氨基酸对于维持酶分子的催化活性具有至关重要的作用。对N165A和Y227A降解RAC的产物谱进行分析,发现随着反应时间的增加,主要产物是纤维二糖、纤维三糖和纤维四糖,而野生型蛋白的主要产物中没有纤维四糖,说明N165A和Y227A突变体的最小结合糖单元不再是纤维四糖而是纤维五糖,说明完全保守氨基酸的突变能够改变酶分子的最小结合糖单元以及作用模式。3、通过突变和功能分析发现,CHCEL5A活性架构中2亚位点氨基酸对维持酶功能具有更加重要的作用。W61位于CHCEL5A活性架构2亚位点,Y203位于1亚位点,是其活性架构中的相对不保守氨基酸。W61Y的CMC酶活降低降低了72%。W61Y的KM升高,KCAT降低,说明W61Y的突变使酶分子与底物间的结合力降低,产物释放变慢。从结构上分析,W61是CHCEL5A活性架构中5A范围内的氨基酸,将W61突变成Y后,其与2位糖环中C6的距离为82A,其与底物失去了相互作用,最终影响了酶活Y203W的CMC酶活降低了68%,从结构上分析,Y203与1位的C3形成一个氢键,突变成W之后,W与底物不会形成氢键有利于产物释放。Y203W的KM升高,KCAT也升高,但KCAT/KM降低,说明KCAT的升高不足以弥补KM的升高对酶活造成的影响,从而酶活降低。2亚位点W61Y的酶活改变较1亚位点的Y203W明显,且产物谱中降解四糖的能力减弱,因此2亚位点对于维持酶活力具有重要的作用。4、利用荧光光谱法测定了CHCEL5A活性架构中亚位点氨基酸与底物的结合力,同时发现PNP类物质不适宣作为底物来表征纤维素酶的性质。酶分子中的色氨酸可以被295NM的激发光激发,当酶分子与底物相互作用后导致荧光淬灭,根据STERNVOLMER方程计算出色氨酸与底物之间的结合常数和结合力。本文利用荧光光谱的方法测定了CHCEL5A活性架构中关键芳香族氨基酸W61Y、W287A、Y203W与三种底物PNP、PNPC、CMC的结合常数,分析了CHCEL5A中单个芳香族氨基酸的突变对于底物结合力的影响,并且证明该方法在整个GH5、GH12家族中具有普适性。CHCEL5A以及三种突变体与PNP、PNPC的KA值大于与CMC的KA值,说明PNP类物质能够高估结合常数约100500倍,定量表明了PNP类物质作为底物来表征纤维素酶的性质是不合适的。
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      上传时间:2019-03-28
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    • 简介:糖胺聚糖(GLYCOSAMINOGLYCANS,GAGS)是一类在多种生物学过程中发挥重要作用的多糖,并且与多种疾病息息相关。硫酸软骨素AC外切酶CHONDROITINSULFATEACLYASE,CHNAC,EC4225可以降解包括硫酸软骨素CHONDROITINSULFATE,CS和透明质酸HYALURONICACID,HA在内的多种GAGS,生成非还原端包含4不饱和葡糖醛酸的相应二糖。研究发现,多种野生微生物可以表达CHNAC,这些酶的编码基因大部分已经确定。天然或者重组表达的微生物来源的CHNAC作为降解工具酶被并广泛的应用于GAGS糖链结构研究和序列分析。本课题的主要内容包括1本课题组此前从土壤中筛选到一株高产硫酸软骨素降解酶CHONDROITINSULFATELYASE,CHSASE的节杆菌属ARTHROBACTERSP菌株SSAS1。通过分子生物学手段克隆该菌株表达CHSASE的编码基因ASCHNAC。首先设计简并引物,PCR扩增得到中间部分基因序列然后通过INVERSEPCR方法得到下游基因序列通过GENOMEWALKING技术得到上游基因序列最后序列分析确定该基因起始密码子ATG和终止密码子TAG,确定编码CHSASE的基因序列的开放阅读框架。2实现ASCHNAC基因在大肠杆菌表达系统中高效重组表达,并优化了该基因编码的蛋白的诱导和纯化条件。3通过氨基酸残基序列同源比对分析和纯化酶分子底物特异性分析,确定本课题自节杆菌SSAS1克隆获得的CHSASE为硫酸软骨素AC外切酶CHNAC,并命名为ASCHNAC。4系统分析了该新型ASCHNAC的酶学参数,以化学酶法合成的结构确定的寡糖系列底物首次确定了CHSASE对底物糖链的酶解方向。尽管微生物CHNAC的底物特异性和蛋白质晶体结构已有一定的研究基础,但由于结构均一确定模式底物的缺乏,使其降解糖链的催化方向性仍然未知。本课题首次利用化学酶法寡糖合成技术制备了四种肝素软骨素嵌合寡糖底物,通过电喷雾质谱ESIMS技术分析了ASCHNAC处理四种寡糖的降解产物的结构。实验结果表明,ASCHNAC可以降解位于底物寡糖糖链还原端的GALNACΒ1,4GLCA单位然而当GLCNACΑ1,4GLCA单位位于寡糖糖链的还原端时,却阻碍了ASCHNAC降解寡糖糖链中间和非还原端的GALNACΒ1,4GLCA单位。上述实验结果直接证明了CHNAC对底物的催化方向为从还原端向非还原端降解。本课题的结论深化了我们对ASCHNAC催化模式的认识,对了解微生物来源的糖胺聚糖分解酶的研究具有重要的科学理论意义,而且相关成果可以直接指导ASCHNAC在GAG结构分析、低分子量GAG制备等领域的应用,也为未来对该酶分子的定向进化获得功能特定突变体提供了理论基础。
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      上传时间:2019-03-27
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    • 简介:蛋白质是生物体的基本构件。深刻阐明蛋白质的结构与功能,是探索生命奥秘的核心任务。有研究发现蛋白质对于生物体存活的重要性存在差别,由此可以将蛋白质划分为关键蛋白质和非关键蛋白质。随着测定蛋白质间相互关系的高通量生物实验技术快速发展,使得可用的相互作用数据海量涌现。据此构建蛋白质相互作用网络并在其上开展相关的关键蛋白质预测等研究以促进生物学医学等基础学科深入发展成为当前相关领域的研究热点。另一方面,结构决定功能是分子生物学上的一条经验法则,对关键蛋白质的研究也有助于更进一步加深对蛋白质在生物体内功能的理解。为此,在蛋白质相互作用网络上对关键蛋白质的预测算法开展研究,主要从网络节点拓扑中心性,蛋白质多信息融合机制以及算法自适应机制等多个角度开展关键蛋白质预测算法的相关研究。同时结合对关键蛋白质预测算法的研究成果,对其在蛋白质复合物预测中的应用也进行了研究。全文主要工作概括如下1在蛋白质相互作用网络上基于网络节点拓扑中心性预测算法是一类重要的预测方法,现有中心性预测算法的设计思路多集中在蛋白质相互作用数据集上挖掘关键蛋白质的特征,忽略了关键蛋白质与真实蛋白质复合物在结构上的关联,这或许是现有算法预测性能不佳的原因之一。鉴于以上考虑,系统分析了真实蛋白质复合物中节点的拓扑特征与复合物包含关键蛋白质数目的关联,提出了一种基于网络节点局部互作密度的关键蛋白质预测新算法LID。该算法在相关数据集上与现有经典网络拓扑中心性预测算法相比较,具有更好的预测结果。2从已有研究成果来看,利用蛋白质网络拓扑单一特征设计预测算法,从而获得较好的关键蛋白质预测性能仍旧十分困难。因此基于蛋白质多信息融合预测关键蛋白质是相关研究可选的途径。目前多信息融合预测关键蛋白质算法的融合机制通常需要人工手动设定经验参数值,这需要大量的实验来获取,且参数值一旦设定一般不能轻易改变,从而增加了相关预测算法对特定相互作用数据集的依赖性。为此提出了一种多信息融合的新机制,并在此基础上融合网络节点局部互作密度LID与真实蛋白质复合物节点内度两类蛋白质生物信息,构建了一种多信息融合关键蛋白质预测新算法LIDC。该算法的融合机制不需要人工经验参数,降低了算法对特定数据集的依赖性。与现有经典多信息融合预测算法以及提出的新算法LID进行实验对比中,在多个评估指标下,取得了较好的预测结果,从而为蛋白质多信息融合机制研究提供了途径。3现有网络节点拓扑中心性关键蛋白质预测算法缺乏自我调节的部分。设计合理的调节机制,可以使得原有的网络拓扑中心性预测算法拥有合理的自适应性,以应对蕴含不同网络结构的蛋白质相互作用数据集上的预测任务。由此通过研究发现存在网络节点拓扑特征,即是局部互作密度非均衡性指标LIDH,与蛋白质网络结构间差异存在某种关联,使之可以用来引导相关预测算法的自行调整。在构建蛋白质相互作用数据集上的先验网络集合基础上,提出了以基于网络节点局部互作密度预测算法LID的拓展形式,网络节点广义局部互作密度为核心的关键蛋白质预测新算法GLID,该算法不依赖人工经验参数,具有恰当的自适应功能。同时该算法虽然使用到了先验知识,但相关信息仍旧来自蛋白质相互作用数据集,并未增加蛋白质生物信息种类和算法的数据依赖性。在与现有经典网络节点拓扑中心性预测算法以及提出的新算法LID在以往预测性能下降较快的数据集上进行对比实验中,该算法取得了较好的预测性能提升效果,为基于网络节点拓扑中心性关键蛋白质预测算法相关研究提供网络结构自适应机制。4生物体内的蛋白质要执行相应生物功能的一般形式是多个蛋白质协同合作,共同完成。而蛋白质复合物正是蛋白质间这种协作的客观体现。因此在蛋白质相互作用网络中识别蛋白质复合物研究对于理解生物体复杂工作机制具有重要作用。已发表的蛋白质复合物预测算法大多基于聚类思想来实现在网络中蛋白质复合物的发现,其聚类机制多侧重于数学意义上的节点划分,且时间复杂度偏高。另一方面,现有生物实验已经发现真实蛋白质复合物内部还存在更微观的结构,其内部的蛋白质还可以划分为核心成员和附属成员等。受此启发,考虑在蛋白质相互作用网络中对关键蛋白质预测算法研究成果的推广应用,提出了基于网络节点局部互作密度的蛋白质复合物预测新算法CBLID。该算法首先利用网络节点的局部互作密度LID分值生成聚类种子集合随后将种子的互作邻接点分配到对应聚类中完成聚类最后清除重复的聚类,得到当前网络的蛋白质复合物候选集。算法CBLID相比较于现有经典蛋白质复合物预测算法具有更小的时间复杂度,且在选取多个蛋白质相互作用网络上,与已有算法的对比实验中,在多个评估指标下,该算法取得了较好的预测结果,从而为蛋白质复合物预测研究提供了思路。
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      上传时间:2019-03-27
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      上传时间:2019-03-26
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    • 简介:聚合酶链式反应PCR技术是生物医学研究中的基本实验手段,自从其发明以来,人们对其改进的研究就没间断过。本课题主要是把一种纳米材料碲化镉CDTE量子点作为添加剂加入PCR体系中,研究其对聚合酶链式反应的影响。本课题主要从四个方面对CDTE量子点作为PCR的添加剂的可行性进行了分析。第一,CDTE量子点对PCR影响的实验模型和实验条件的建立第二,CDTE量子点对普通PCR特异性和灵敏度及稳定性的影响研究第三,CDTE量子点对QPCR特异性和灵敏度及稳定性的影响研究第四,CDTE量子点对PCR扩增忠实性的影响研究。1CDTE量子点最佳添加浓度的摸索采用浓度梯度的方式确定CDTE量子点的最佳浓度为00833MG/ML,并针对CDTE量子点对普通PCR的影响和CDTE量子点对QPCR实时定量PCR的影响,确立了本课题所需要的实验的模型。2CDTE量子点对普通PCR的影响。实验结果表明,当CDTE量子点浓度为00833MG/ML时对PCR有明显的增效作用,表现在产物产量的增加,灵敏度提高100倍,特异性增强,且稳定性测试在第三轮仍有扩增。不同CDTE量子点对PCR的影响从3种尺寸相近的不同CDTE量子点对PCR的产量与退火温度方面着手,实验结果表明不同CDTE量子点对PCR产量的影响是不同的,但是对PCR退火温度的影响是相似的。3CDTE量子点对QPCR的影响。第一,最佳浓度的CDTE量子点对QPCR的影响与对普通PCR的影响一致,即能够提高PCR的产量,灵敏度,特异性。第二,不同浓度CDTE量子点对QPCR的影响,向PCR体系中分别加入0ΜL,04ΜL,1ΜL,4ΜL,7ΜL的1MG/ML的CDTE量子点,则在12ΜL中的量子点的浓度依次为0MG/ML,0033MG/ML,00833MG/ML最佳浓度量子点,033MG/ML,05833MG/ML,当CDTE量子点超过最佳添加浓度时,对PCR有抑制作用。第三,不同CDTE量子点对QPCR的影响的实验,在普通PCR的基础上,对两种不同CDTE量子点进行比较实验,得出结论尺寸小一点的CDTE量子点的灵敏性比尺寸大的高。第四,QPCR的稳定性实验,主要通过QPCR的重现性来测试的,实验结果表明添加CDTE量子点的PCR实验具有可重复性。4CDTE量子点的保真性检测实验中,通过RPSL体内测试和体外测试两种方法得出CDTE量子点能够使PCR的忠实性下降。表明其具有一定的分子毒性。但是通过DNA测序显示其并没有引起PCR产物序列明显的变化。本研究的主要创新点是CDTE量子点可有效用于QPCR,并结合荧光染料SYBRGREENI和EVAGREEN的使用,已研制出新型的QPCR试剂盒。该试剂盒已经投入到产品生产中。
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      上传时间:2019-03-26
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    • 简介:蛋白质的鉴定是蛋白质组学的一个重要分支,其目标主要是对生物体内的蛋白质数量与种类进行鉴定。基于串联质谱的质谱测序技术已经成为现阶段蛋白质序列鉴定的核心技术之一。在生物实验室中,每天都有大量的质谱数据产生,其数量远超出了人工处理数据的能力。目前基于串联质谱数据对蛋白质鉴定主要有三种方法,分别为数据库搜索方法、从头测序方法和肽序列标签查询方法。数据库搜索方法是最为常用的一种方法,其主要算法是基于串联质谱数据的肽谱匹配算法。串联质谱鉴定的目标是根据给定的质谱数据推算出氨基酸序列,进而推断出蛋白质,其中关键点是对理论图谱做出正确预测。由于对肽段断裂机理的定性认识不足以做出正确的预测,还需要定量分析断裂机理的影响因素,如断裂位点以及断裂位点的肽碎片属性等,以提高对理论图谱的准确预测,从而增加蛋白质鉴定的准确度。本文通过阅读文献总结出肽碎片离子特征,将总结的肽碎片离子特征转换为便于计算的实验数据,使用梯度提升决策树算法来构建离子强度预测模型并做出理论预测。首先,对原始串联质谱数据集做预处理,对处理后的数据使用蛋白质鉴定引擎PFIND进行鉴定;其次,设定过滤条件对鉴定出的结果进行过滤操作,获得高可信的肽序列;第三,计算出肽序列中的离子质荷比与离子特征值,通过匹配质谱数据中离子的质荷比获取对应的离子强度信息,使用强度信息与离子特征值构建实验数据;第四,将实验数据划分为训练数据、验证数据与测试数据,使用梯度提升决策树算法在训练数据与验证数据上构建预测模型;最后,使用构建完成的预测模型对测试数据做离子强度理论预测。分析理论质谱肽序列的离子强度与实验质谱离子强度的相似度和及皮尔森相关系数,结果表明构建的预测模型有着较高的准确率,并且可以从预测树中总结出对强度值影响较大的离子特征。
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      上传时间:2019-03-21
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    • 简介:对于血红素蛋白来说,蛋白质硝基化是一种重要且常见的翻译后修饰,用来调控蛋白质的结构与功能。肌红蛋白MB是一种理想的蛋白质模型,常用来研究血红素蛋白结构与功能之间的关系。由于实验中有限的硝基化血红素蛋白结构信息,本文我们通过计算机分子模拟,研究了人MB中连续硝基化TYR103,TYR146,TRP7和TRP14后结构的变化,来探究硝基化后MB的分子动力学。我们以天然状态下的MB为参照,详细地比较了硝基化后MB的一些变化行为,比如蛋白分子的运动,分子内部之间的相互作用以及内部空腔的变化等。研究表明,尽管通过硝基化TYR103和TYR146只会稍微改变蛋白血红素活性中心的局部构象,但进一步硝基化MB远端A螺旋区域中的TRP7和TRP14,会导致蛋白内部空腔的巨大改变形成了一个水分子通道,这表明连续硝基化会导致MB处于一个未折叠的初始状态。本文意义在于,在原子水平上,利用计算机模拟来研究血红素蛋白硝基化后的构象变化,也为探究非天然状态下血红素的硝基化作用提供了信息,对理解血红素蛋白的结构与功能之间的关系有着重要的指导意义。在构建功能性的人工金属蛋白时,蛋白质分子设计已被证明是一个强有力的工具。现在虽然有许多单活性中心的人工金属蛋白陆续被成功创造,但是基于同蛋白骨架构建双活性中心的人工金属酶还是很少报道。本文的研究是在血红素蛋白中的肌红蛋白(MB)骨架上,巧妙地设计了两个活性中心,一个是MB自身的血红素活性中心,另一个是通过氨基酸定点突变技术,把MB中远离血红素中心的118位点的精氨酸突变成组氨酸(R118HMB)或甲硫氨酸(R118MMB)从而构建的一个铜结合位点。通过等温热量滴定(ITC)和电子顺磁共振波谱(EPR)的研究,我们证实,在单突变体R118HMB中的三个组氨酸(H24/H118/H119)位置上可以结合一个铜离子,同样单突变体R118MMB中的两个组氨酸与一个甲硫氨酸(H24/M118/H119)位置上也可以结合一个铜离子。再通过紫外UV光谱动力学与EPR波谱学的进一步研究,我们证明了血红素中心和构建的铜结合位点都具有亚硝酸还原酶催化活性。本研究为基于同蛋白骨架上合理设计双活性中心提出了一种新的方法,也为进一步探究血红素蛋白/非血红素蛋白的功能与结构之间的关系打下了基础。
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      上传时间:2019-03-18
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    • 简介:微生物广泛分布于地球表面各处及各种极端的环境,微生物与微生物之间或与其他生物存在着各式各样的依存关系。在自然界当中,微生物不仅参与了自然界的C、N、S等元素的循环,而且在农业中以菌造肥、以菌防病、以菌催长,在工业中制造皮革、处理废水、降解有机磷和有毒物质,在发酵工程和酶工程上也起着重要的作用。然而少数有害微生物也对人类生活造成危害,主要表现为水体中肠道致病菌和非肠源性的微生物的污染,食品的收获、运输、加工和贮藏过程微生物入侵,以及临床医学中介入性治疗引起的微生物感染造成的危害等。因此,研究微生物在不同环境的生长有助于了解微生物的属性,从而充分利用微生物的有益作用为人类造福,同时超快诊断有害微生物并设法消除有害微生物给人类带来的危害来提供有益的帮助。目前,微生物生长检测方法可以分为两大类侵入式测量和非侵入式测量。早期以侵入式测量方式为主,包括称干重法、菌丝长度测量法、体积测量法、微生物计数法、生理指标法等。但是由于操作者需要学习使用显微镜、梯度稀释菌液、菌液涂布、离心、酸碱滴定、配制溶液等专业技术,并且工作量大,操作耗时长,获取的采样点少,侵入式操作导致的杂菌干扰、培养基含量减少等因素,微生物生长检测结果往往不够精确而且效率低下,所以该类检测方法难以实现快速、精确自动化分析微生物生长。微生物的生长伴随着一系列与生长量相平行的生理指标也发生变化,其中可用于快速生长测定主要包括RNA,DNA,P,ATP,乙酰等含量以及产热,黏度,产酸,产二氧化碳气体(用标记葡萄糖做基质),耗氧,透光度等指标。这些物质也是构成当前非侵入式微生物测量方法的基本依据。近年来,可用于分析这些生物指标的微生物传感器陆续被研究者提出,通过反演这些生物指标的变化可以获取微生物的生长状态,也是寻求一种非侵入式、简便、准确、快速、自动化的微生物生长检测方法的主流。二氧化碳作为微生物生长代谢的产物之一,其变化量能实时快速反映微生物的生长情况。目前,基于二氧化碳的检测方案已经快速应用于微生物生长曲线测量。可调谐半导体激光光谱技术TDLAS作为一种响应时间快、高灵敏度、选择性强、高分辨率、结构简单、非侵入式的痕量气体检测技术已经成功的应用于大气检测、工厂排放等领域,而波长调制技术作为一种可调谐半导体光谱技术,通过对入射的激光波长进行调制来压制背景噪声信号,将检测的灵敏度提高二个数量级,进而探测更低的气体浓度。本文依据波长调制光谱技术的优点,研究了一种在封闭空间内、有限有机物条件下的微生物生长曲线测量方法,获得了一种非侵入式、响应时间快、高灵敏度、高分辨率等优势的微生物曲线测量方法,并将该微生物生长曲线测量方法应用于不同温度条件下的微生物生长测量,同时对测量曲线进行拟合,获取了微生物在不同培养条件下的生长参量以及微生物生长与环境因素的关系,同时提出了一种波长调制光谱技术测量的压力补偿方案,克服了测量过程中压力变化带来的测量误差,最后将该研究方法应用于血培养检测。与现有仪器相比较,利用基于波长调制光谱技术的血培养系统测厌氧培养瓶的阳性报警结果与现有仪器结果吻合程度很好,需氧、兼性厌氧培养瓶获得的阳性报警结果仅有1个误差,并且分析造成该结果的原因,检测结果未出现出现假阴性结果,同时检测现有仪器中1个假阳性结果,该方法获得了很好测量结果。本文研究成果将进一步推进TDLAS技术应用于微生物生长检测,为今后的研究做了铺垫,最后对全文进行总结,提出了下一步工作展望。
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      上传时间:2019-03-18
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    • 简介:生物矿化是生物体造就自身生物矿物的过程。从微观尺寸的细菌、真菌到宏观世界的植物、动物,一切生物体的生命活动都缺少不了生物矿物的参与。生物体在严格的生物调控下从外界环境中选择性地摄取元素,并最终合成具有高度有序层级结构和特殊生物功能的矿物。这些矿物在生物体内发挥着机械支撑、保护、光学、磁学等各种功能,同时还被证明在提高生物抵抗外界恶劣环境的能力方面起着重要作用。受到自然界中生物矿化现象的启发,通过仿生矿化手段对不具备自矿化能力的生命体进行改造,可以在提高生命体生物抗逆性的同时赋予其各种特殊功能。蛋白质是生命体的重要组成成分,并且由于其优异的催化性能和作为药物的强特异性,在人类的生产生活中起着越来越不可替代的作用。但是蛋白质往往存在着稳定性差、可操作性差、不易回收利用等问题,因而在很大程度上限制了其在各个领域的应用。所以,找到一种简单有效的手段来提高蛋白质的稳定性具有重要意义。本论文主要内容为通过仿生矿化手段在蛋白质上原位引入无机矿物,提高蛋白质的稳定性并研究其保护机理,同时还进一步将矿化手段与功能纳米材料相结合应用于分析检测方面。全文共分为五章第一章简要介绍了生物矿化的基本内容,包括生物矿物的种类、作用以及生物矿化过程接着归纳了仿生矿化的基本原理、有机基质在调控仿生矿化过程中所起的作用及该方法用于生命体改造的相关应用等随后概述蛋白质的基本知识及其在应用过程中存在的问题,同时介绍了目前提高蛋白质稳定性的一些方法,并引出通过仿生矿化手段提高蛋白质稳定性的设想最后提出本论文的研究思路和目标。第二章通过原位矿化手段在蛋白质表面引入无定形磷酸钙矿物,这层无机外壳可以大大增强矿化蛋白的热稳定性。随后对蛋白分子结构、氢键交换速率以及无定形矿物含水量等进行研究,深入探讨了矿物对蛋白分子的热保护机理。无定形矿物相中的结构水分子通过紧密连结在矿化蛋白周围,从而形成一种稳定的水合状态,降低蛋白分子与外界环境中水分子的氢键交换速率,减少热运动过程对蛋白构象的破坏,提高蛋白质在高温环境下的稳定性。第三章选用在生物抗逆性方面表现更为突出的二氧化硅为矿化材料,利用原位矿化与功能纳米材料相结合的方式为蛋白分子引入矿化外壳。首先经化学修饰为蛋白分子共价连接上具有诱导硅矿化作用的聚乙烯亚胺分子,并用磁性纳米颗粒对修饰后的蛋白进行富集,最后通过原位硅矿化方法在蛋白分子表面生成二氧化硅矿化层。实验结果表明,这种矿化方法不但具有很高的蛋白矿化率,并且能够显著提高蛋白分子的热稳定性、温度适用范围以及抗有机溶剂的能力。这种基于生物矿化的材料蛋白相复合的方法为今后蛋白或其他生物大分子的矿化提供了一个新的思路。第四章利用磁性纳米颗粒的类过氧化物酶活性以及硅矿化对葡萄糖氧化酶在酸性条件下的稳定性提高,我们将合成好的FE3O4C葡萄糖氧化酶二氧化硅纳米复合物用于一步法检测葡萄糖。该方法具出良好的线性范围、高灵敏度,高底物选择性,并且由于磁性纳米颗粒的存在使该复合物易于通过磁铁进行回收,表现出很好的可重复利用性。这种将功能纳米材料和矿化手段相结合,同时利用材料和生物大分子特有性质的策略,在生物传感、分析检测等各个方面具有很大的应用潜力。第五章对本论文的工作进行总结,说明生物矿化手段能够提高矿化蛋白质的稳定性,以及无定形矿物相中结构水在稳定蛋白分子方面的重要作用,并提出将该方法与功能纳米材料相结合应用于生物传感等方面具有很好前景。同时,我们还指出了本工作中存在的不足和需要解决的问题,为今后的研究提供指导意义。
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      上传时间:2019-03-18
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    • 简介:CRISPR/CAS9技术是新近发展起来的由SGRNA指导CAS9内切酶特异性识别基因位点并进行编辑的技术,能够在复杂的基因组和RNA水平引入精细的改变或沉默,相较于之前的锌指核酸酶技术ZINCFINGERNUCLEASE,ZFN和转录激活子类似的效应子核酸酶技术TRANSCRIPTIONACTIVATORLIKEEFFECTORNUCLEASES,TALEN,CRISPR/CAS9的设计和使用更加方便快捷,并且不需要对序列特殊地分析,也不需要对应地去寻找识别模块,其具有极大的应用优势。本研究针对牛肌肉抑制素基因MYOSTATIN,MSTN第二外显子的一段序列设计构建了CRISPR/CAS9A打靶载体,针对MSTN的第二外显子的另一段序列同时设计并构建了一组ZFNS和一个CRISPR/CAS9B打靶载体,然后使用电转染方法分别将ZFNS载体和CAS9载体转染到牛胎儿成纤维细胞中,通过口吸管挑取单细胞并扩培,利用PCR和测序检测突变体的产生。结果显示,ZFNS转染所获得的74株细胞克隆中含有4株基因突变细胞系,敲除效率为512%CRISPR/CAS9A转染的17株单克隆细胞中含有1株敲除细胞系,且为缺失8BP的双等位基因敲除细胞系,敲除效率为588%CRISPR/CAS9B转染的77株单细胞克隆中有21个突变细胞系,敲除效率为2705%,其中包括2株双等位基因敲除细胞系,分别为3BP插入突变和13BP缺失突变,双等位基因的敲除效率为952%。以上结果表明,针对第二外显子的打靶载体CRISPR/CAS9B的打靶效率高于CRISPR/CAS9A打靶载体,而针对同一位点的CRISPR/CAS9B的敲除效率约是ZFNS的敲除效率的5倍。进而为了检测ZFNS和CRISPR/CAS9B的外源整合效率,针对ZFNS和CRISPR/CAS9B靶向位点构建表达HFAT1和EGFP基因的质粒PFLRKT和PGLRKT,在外源基因的5端和3端分别带有与靶向位点序列相同的885BP和823BP的同源臂。通过电转染的方法将ZFNSPFLRKT/PGLRKT和CRISPR/CAS9BPFLRKT/PGLRKT分别导入到牛胎儿成纤维细胞中,经过G418筛选、细胞单克隆制备和同源臂跨臂PCR检测,最终获得外源基因定点整合的细胞系。经过鉴定,在95株ZFNS介导的PGLRKT定点整合的细胞系中共获得13株打靶细胞,打靶效率为1368%,未获得PFLRKT定点整合细胞系使用CRISPR/CAS9B介导的PFLRKT载体定点整合的81株细胞系中获得64株打靶细胞,PGLRKT载体定点整合的119株细胞系中获得74株打靶细胞,其打靶效率分别为7901%和5784%。实验证明,CRISPR/CAS9介导的基因打靶效率明显高于ZFNS,约为ZFNS的5倍。本研究最终共获得26株MSTN敲除的牛胎儿成纤维细胞系和64株FAT1定点整合细胞系,这些细胞为后续的体细胞核移植和胚胎移植提供了可选的供体细胞。同时实验证明,在牛上,CRISPR/CAS9系统介导的基因打靶效率要明显高于ZFNS。
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      上传时间:2019-03-18
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    • 简介:此论文中主要讨论了非天然氨基酸标记的方法和应用,19FNMR的优势和在各领域中的应用。我们结合非天然氨基酸标记和19FNMR来研究蛋白质的结构和功能,本论文共分为六个章节。第一章介绍了非天然氨基酸标记的方法及其应用。通过非天然氨基酸的引入来研究生物学过程,可以解决传统方法无法解决的一些问题。将非天然氨基酸位点特异性引入最有力的方法是通过遗传密码子扩增,该方法在需要标记的位置引入琥珀密码子TAG突变,筛选到能识别琥珀密码子的氨酰TRNA合成酶/TRNA对将非天然氨基酸引入,另外,可以通过化学连接方法辅助这种非天然氨基酸引入的方法。非天然氨基酸也可以通过选择压力的方法以氨基酸特异性的方式引入,这种方法会导致基因组特定氨基酸全方面的标记,而不是定点标记。本章还重点介绍了氨基酸特异性和位点特异性两种非天然氨基酸标记方法在各方面的应用以及在一些前沿科技方面的应用。第二章介绍了利用19FNMR研究蛋白质的结构和功能。19F自旋量子数为1/2,自然丰度是100%,磁旋比高,没有背景信号干扰,灵敏度高,使用氟原子代替氢原子不会明显的影响分子的结构,19F核的多种特性使其成为研究生物学过程的有力工具。核磁共振能研究蛋白质的结构,功能,底物结合,构象变化等信息。本章第一部分总结了氟核应用于核磁共振的优势,接下来介绍了氟标记蛋白质和多肽的合成原理和方法,最后重点介绍了结合19FNMR和氟标记探针方法在各领域中的应用,包括研究蛋白质和核酸的结构和功能、药物的开发和筛选、代谢过程、生物活性分子体内追踪等信息。第三章描述了应用位点特异性19F标记和19FNMR研究CRUDELYSATE蛋白质间相互作用。我们成功的通过化学方法合成了非天然氨基酸三氟甲基苯丙氨酸,并利用19FNMR分析两个促分裂原激活蛋白激酶MAPKSMEKK3和MEK5的PB1结构域在天然细胞环境下蛋白质间的相互作用。高度保守的MAPKS家族是一个参与信号转导的重要体系,其中比较重要的是参与从细胞膜到细胞核或细胞内其它位置的信号传递。MEKK3和MEK5在N端都含有一个PB1结构域,它们通过形成二聚体发挥作用。我们将19FTFMF分别插入到MEKK3PB1和MEK5PB1的不同位点,然后通过19FNMR化学位移变化和弛豫分析MEKK3PB1和MEK5PB1的相互作用界面,我们还证明了MEKK3PB1和MEK5PB1共纯化样品结合界面标记位点的化学位移变化与在细菌浓浆样品CRUDELYSATE样品中的变化一致。第四章介绍利用19F固体核磁共振来研究蛋白质的磷酸化信息,以及在苯乙烯马来酸酐(STYRENEMALEICANHYDRIDE,SMA)作用下形成的脂碟LIPODISQ对细胞膜环境的改变。我们证实了苯乙烯马来酸酐包裹形成的单层囊膜脂碟在膜蛋白相关结构和功能研究中的优势。饼状胶束BICELLES和纳米碟NANODISCS,虽然也可以提高底物与膜蛋白的接触几率,但或需要特殊脂质,或需要去污剂参与,或由于膜支架蛋白的影响,使其都不是最佳的研究介质。LIPODISQ一方面能维持完整的细胞膜环境,另一方面还可以提高底物与膜蛋白的接触几率,为利用19F固体核磁共振方法或者其它生物物理方法研究天然细胞膜环境下配体受体结合,酶学分析,蛋白质间相互作用提供了便利。第五章主要介绍小分子荧光探针的发展以及在生物学中的应用,结合非天然氨基酸标记和小分子荧光探针L7HYDROXYCOUMARIN4YLETHYLGLYCINE荧光寿命等荧光特性研究蛋白质的结构和功能。第六章主要介绍了非天然氨基酸标记和19FNMR技术的展望。在细胞天然环境下研究蛋白质结构和功能更能反应其真实的生物物理信息,非天然氨基酸标记技术和核磁共振技术的发展为这些研究提供了有力的工具。
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      上传时间:2019-03-18
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    • 简介:生命体的核酸和蛋白质序列在进化过程中具有相对的稳定性,同时包含着海量信息。对生命体进行研究,归根结底是对核酸、蛋白质等生物大分子进行研究。对生物序列的研究分析,有助于研究生物序列之间的关系,解读生物遗传信息,从而能够为人类治愈各类疾病、提前预防疾病提供可能。决定生命体结构和功能的是蛋白质,随着大量蛋白质数据集的产生,以及各类计算机软件的不断完善与发展,对蛋白质序列的研究进入了快车道。因此本文利用蛋白质的序列进行进化分析。本文的成果和创新之处在于以下几个方面第一,坐标表示。采用分类和依据原始数据两种表示形式,考虑了对氨基酸性质有影响的多种重要理化性质,全面刻画氨基酸。对于横坐标,采用定性描述的方式,选取极性和亲水性两种性质,按照影响因子大小赋予权重,作为分类依据,并对每一类进行自定义赋值。纵坐标依据等电位点值PI进行定量描述。本文的图形表示是在考虑理化性质的基础上,采用定性与定量相结合的方法定义氨基酸坐标,这样既考虑了相似氨基酸的共性,又考虑了每个氨基酸的个性。第二,在对蛋白质图形表示时,充分考虑氨基酸所在位置信息。在得到蛋白质序列横纵坐标后,运用本文定义的相邻距离向量提取图形特征。同时针对蛋白质序列不等长的问题,进行等长处理。为了考虑相邻位置不同氨基酸顺序之间的相互影响,本文在对氨基酸分成5类的基础上,定义三联体的相对概率,得到第三条特征向量。第三,对本文方法进行了推广。为了使本文方法对于序列长度较短的数据集仍具有适用性,避免出现部分三联体或二联体数目为零的情况,我们采用25个二联体相对概率作为其特征向量,取得了很好的分类效果。在本文中,我们在图形表示时综合考虑了氨基酸部分重要的理化性质、氨基酸的位置信息、相邻氨基酸的相互影响。在描述图形特征的时候引入相邻距离向量的概念,并提出了对序列等长处理的方法。得到能够准确表示蛋白质序列信息的特征向量。通过利用相应的距离公式,进行进化分析。本文在ND5、24条转铁蛋白数据集中进行验证,发现利用本文的图形表示和考虑氨基酸顺序的思路能够准确地对其进化分析,同时推广到27条抗冻蛋白数据集中,也取得很好的分类效果。
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      上传时间:2019-03-18
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    • 简介:随着改革开放的不断深入,国民经济高速增长,我国食品药品行业迎来了前所未有的快速发展。然而近几年,一些商家通过在食品或者保健食品中加入药物成分,从而使产品获得本身不具备的功效,以此获取暴利。本文针对食品药品中非法添加硝苯地平的行为,研发可检测硝苯地平的胶体金层析试纸条,为食药监管部门日常基层监管工作提供帮助。首先,采用活泼酯法制备硝苯地平人工抗原,通过紫外光谱法对人工抗原进行初步鉴定,结果表明人工抗原偶联成功。其次,通过动物免疫试验制备硝苯地平单克隆抗体,建立ELISA法对单克隆抗体的效价和特异性进行了测定,单克隆抗体腹水效价为L5L04~L2L05,抗体(J5F4)对硝苯地平的IC50为2253NG/ML,同尼群地平、尼莫地平的交叉反应率分别为957%和630,得到的抗体特异性较好。最后,通过制备纯化金标抗体、组装试纸条,确定影响每个步骤的因素参数,获得制备胶体金层析试纸条的最佳条件,制备的胶体金粒径为20~40NM,单抗的最佳标记量为50ΜG/ML,单抗标记最佳的PH为90,抗原的最佳包被量为70ΜL,二抗的最佳包被量为90ΜL,胶体金标记抗体量为50ΜL,胶体金免疫层析试纸条的目测检测限为10MG/L。经验证,所研发的硝苯地平试纸条的重复性、稳定性、假阳性及假阴性率也均符合要求。本研究研发出硝苯地平胶体金免疫层析试纸条,并确定制备胶体金层析试纸条的最佳条件,为检测硝苯地平提供了一种省时、高效、操作简单的检测方法,为监管部门现场初步筛选提供技术支持,同时为其他非法添加物试纸条的研制提供借鉴。下一步,将尝试对一些结构相似的药物使用其共同部分设计人工抗原,再以此为基础研制可以筛查一类药物的试纸条,最终大大提高现场筛查的效率。
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      上传时间:2019-03-17
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