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    • 简介:定量重建地球生态系统的气候参数是当前国际古气候研究的目标之一自20世纪70年代以来,尤其是在海洋学研究领域,新技术的不断应用使得定量的古气候研究蓬勃发展相比之下陆地古气候参数的重建要困难得多,陆地植物作为对环境的良好记录,一直备受重视近数十年来,国际上广泛开展了利用植物材料定量研究气候的探索,大量新的方法层出不穷德国科学家MOSBRUGGER和UTESCHER在1997年倡导的共存分析法THECOEXISTENCEAPPROACH就是其中之一,它依据现存最近亲缘类群原理以及植物分布与气候的关系原理,找到化石植物群中各类群的现存最近亲缘类群对各气候参数的耐受范围并将各亲缘类群对同一气候参数的耐受范围叠加一起,获得对该气候参数的共存区间,用该区间作为对古气候参数的精确估测本文首先阐述在原文位于展开讨论的共存分析的理论基础探讨植物分布与气候之间关系的耐受性理论并以此为指导,对在该方法中气候台站的选用方法作了改进,气象台站的选择应以植物的标本记录点为基础即使在某一特定的植物分布区内部也应该查看气象台站所在县级行政区域是否有该植物的标本采集信息,并以此为依据来决定是否选用该气象台站的记录;选用的气象台站的数量多寡应该以植物分布点的多少来决定以此为基础,我们采用中国的植物分布与气象记录数据,利用孢粉学的研究结果,定量重建了我国新生代三个地点的古气候参数,结果如下1内蒙古呼伦湖地区全新世初期气候MAT44~102℃;MWMT229~241℃;MCMT1~91℃;DT335~409℃;MAP3543~6867MM;MMAP1038~1919MM;MMIP27~73MM我们以扎赉诺尔地区的孢粉学研究为基础,依据孢粉和盘星藻PEDIASTRUMMEYEN提供的环境信息并结合前人工作,恢复了全新世初升温期的植被变化定量重建了104~102KABP时的气候,为全面理解呼伦湖地区的气候变化以及东亚的夏季风变化提供新的依据2云南洱源上新世气候MAT133~186℃;MWMT246~275℃;MCMT19~121℃;DT142~166℃;MAP6199~14843MM;MMAP1438~2456MM;MMIP127~164MM该结果与羊邑、龙陵上新世古气候及三地的现代气候分析对比表明,在上新世,三地年均温符合纬向变化,而降水量则基本一致在现代,洱源与羊邑在气候与植被上很相近,且与上新世相差不大;而龙陵地区则发生了显著的变化,年均温比上新世低,而降水量则大幅增加该变化指示了上新世以来作为青藏高原东部边缘的龙陵地区可能出现了地形的抬升3吉林珲春始新世和中新世气候始新世MAT143~149℃;MWMT25~263℃;MCMT19~37℃;DT217~23℃;MAP7975~1344MM;MMAP1853~2098MM;MMIP142~164MM中新世MAT143~149℃;MWMT243~254℃;MCMT21~37℃;DT217~227℃;MAP6587~8177MM;MMAP1589~1746MM;MMIP74~76MM通过对两个时段的气候参数对比,始新世时,吉林珲春地区的气候属于北亚热带气候;中新世时气候发生了改变,归属于暖温带南部的气候,改变了前人关于中新世也归属于被亚热带的认识,这反映了我国东北部地区与全球新生代降温总趋势具有一定的同步性
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    • 简介:味觉是哺乳动物极为重要的感觉,其中苦味是五大基本味觉之一。苦物质受体近期被广泛发现于身体的各个组织细胞中,如胃肠道细胞,睾丸细胞,神经细胞和呼吸细胞。近期的研究表明苦物质受体参与了气管平滑肌细胞的舒张作用,其过程是在给气管平滑肌细胞激动剂如乙酰胆碱,引起气管收缩之后,再加入苦物质如CHLOROQUINE,能够使气管平滑肌细胞舒张。但是在气管平滑肌细胞静息状态下,单纯加入苦物质却引起了气管平滑肌细胞的钙离子的升高。这看似矛盾的作用使得苦物质作用于气管平滑肌细胞的机理急待阐明。本文一方面研究的是通过测量气管肌张力的方法,给完预刺激之后,在给激动剂乙酰胆碱的时候再给苦物质CHLOROQUINE能引起气管的舒张并且用激光共聚焦双记录的方式,我们把钙离子用特异性的染料FLUO4染色,通过透射光和激光的双记录,我们看到细胞收缩的同时,CHLOROQUINE能降低细胞的钙离子,我们认为这是引起气管舒张的主要原因。另一方面研究的是苦物质CHLOROQUINE在静息状态下能否引起气管平滑肌细胞的收缩,并阐明其机理。通过气管环肌张力测量的方法,在给完3次乙酰胆碱预刺激之后,静置30分钟使气管恢复,观察气管在静息状态下加入CHLOROQUINE时,能引起气管平滑肌的一过性的收缩,为了证明引起收缩作用的钙离子是来源于细胞外的钙离子进入,还是细胞钙库中的钙离子释放入胞浆,我们先用无钙离子的细胞外液进行相同的实验,CHLOROQUINE依然能引起收缩。为了进一步验证,我们用钙泵阻断剂CPA使细胞内钙排空后再加入CHLOROQUINE,则收缩作用被阻断。这两方面同时印证了CHLOROQUINE引起气管平滑肌收缩的机理是使细胞内钙释放进入胞浆,胞浆钙离子浓度升高引起了收缩。苦物质引起的收缩是一过性的,其模式很像内钙释放所引起的,我们就观察CHLOROQUINE对IP3受体的影响,用IP3受体阻断剂2APB阻断后,加CHLOROQUINE后气管平滑肌无收缩,则CHLOROQUINE作用于IP3受体使内钙释放的,其上游通路GPROTEINPLC可能发挥了作用,通过特异性的GΑ阻断剂PTX培养气管环过夜,再加入CHLOROQUINE时,其收缩作用被抑制,同样的实验用GΒΓ阻断剂GALLEIN则对收缩没有抑制作用。这些数据说明了CHLOROQUINE通过GΑPLCIP3IP3R通路引起细胞内钙的释放,导致了这个一过性的收缩。我们研究发现,苦物质通过苦受体,引起了鼠气管平滑肌收缩,并非舒张,本研究结果对进一步探讨苦物质和苦受体在哮喘气道高反应形成中是否发挥了重要作用,为将来苦物质参与治疗奠定了良好的基础。
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    • 简介:目的筛选和研究红细胞分化相关基因并确定其功能是红系分化研究中的重要课题而这,也是我们的实验目的1,EDRF1、2为红细胞分化相关的CDNA克隆,2,EDRF1调控K562、HEL细胞中珠蛋白的表达及其功能通路3,EDRF1是结合HS2核心序列的红系反式作用因子4,EDRF2全长基因的获得及功能研究5,EDRF2蛋白质三维结构模建及功能活性区的预测6,利用基因芯片技术筛选红细胞分化相关的新基因及功能研究以上研究表明,EDRF1、EDRF2和EDRG1、EDRG2作为红细胞分化相关基因,参与了红白血病细胞K562、HEL细胞的终末分化过程,功能实验研究表明,EDRF1和EDRF2对一系列的红系特异基因的表达水平以及转录因子活性进行了调控,报告基因系统结合基因转染技术研究发现,EDRF1蛋白结合珠蛋白增强子序列HS2的92179267段的DNA,作为一个反式因子参与红细胞终末分化的功能信号传递该研究中通过生物信息学的手段,应用计算机分析和模拟的方法初步展示了EDRF2的可能的蛋白质空间三维结构和特性,为它的进一步的功能研究提供一定的线索
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    • 简介:本研究采用未经细胞培养和传代及人类巨细胞病毒HCMV感染终末器官组织的临床株进行大样本的测序研究,探讨UL144、UL139及UL149基因多态性与先天性HCMV感染不同致病性之间的关系,进一步弄清所编码蛋白的生物学功能,进而为在分子水平上揭示HCMV感染的致病机理奠定基础。研究表明1HCMVUL144、UL139及UL149基因核苷酸及氨基酸序列存在多态性。且与疾病有一定的关系,先天性发育畸形及多脏器受累的临床株以UL144IA基因型为主;无症状或轻微临床表现的临床株以Ⅲ型为主。先天性巨结肠临床株UL144基因型以IA为主;UL139基因型以G3型为主。2在一个HCMV感染的机体内可存在2个不同的UL144基因型;HCMV感染宿主体内的UL144、UL139和UL149基因型高度保守;从尿液中排出的HCMV基因型与HCMV感染终末器官的基因型一致。3预测UL144、UL139及UL149基因编码的重要功能位点与临床有关,UL149的CPK位点可能与HCMV引起的骨髓造血功能异常有关。UL139基因编码的功能位点在46~51氨基酸残基之间的MYR基团高度保守和ACP位点的缺失对于先天性巨结肠的发生可能具有一定的意义。4HCMVUL149基因与UL144基因具有相关性,与UL139基因没有相关性;UL144与UL139亦没有相关性。
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    • 简介:目的建立三色法流式细胞术检测T淋巴细胞内细胞因子的方法;探讨核因子ΚB在支气管哮喘患者T淋巴细胞表达TH1/TH2类细胞因子Γ干扰素ΓIFN/白细胞介素4IL4的调控信号传导中的作用。方法1正常人外周血在12肉豆蔻酰13乙酸佛波酯PMA、IONOMYCIN和MONENSIN存在的条件下在体外短期培养,进行细胞膜表面抗原和细胞内细胞因子染色,用流式细胞仪对淋巴细胞内细胞因子进行测定,并对分析方法中细胞膜表面抗体的选择和不同刺激时间对测定结果的影响等进行了探讨。2选取轻中度急性发作期哮喘患者20例,正常对照20例。正常对照组取外周血加入PMA培养。哮喘患者取外周血并分成2组培养。第一组加入PMA,第二组同时加入PMA和核因子ΚB抑制剂二硫代氨基甲醇吡咯烷PDTC。将培养的外周血用三色法流式细胞术检测T淋巴细胞亚群。结果1选用不同的单抗和刺激剂的刺激时间不同,对实验结果有较大影响。2加入PMA培养的哮喘患者T淋巴细胞TH1,TH2,TH1/TH2与正常对照组比较差异有显著性,且与同时加入PMA和PDTC培养的哮喘患者外周血T淋巴细胞组比较也有显著性。哮喘患者TH1细胞、TH1/TH2较正常人明显降低,而哮喘患者的TH2细胞较正常人明显升高。同时加入PMA和PDTC培养的哮喘患者外周血T淋巴细胞组TH1细胞、TH1/TH2较哮喘患者明显升高,TH2细胞明显降低。结论1流式细胞术是单细胞水平检测细胞内细胞因子的较为理想的方法;2细胞内细胞因子检测的影响因素较多,分析时需选择适当的测定条件;3T淋巴细胞活化后使淋巴细胞亚群改变可能是通过核因子ΚB来传导的。T淋巴细胞核因子ΚB信号传导途径的激活可能是哮喘的发病机制之一。
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    • 简介:抗菌肽是对多种微生物、病毒、原虫甚至癌细胞都有明显抑杀作用的小分子多肽,广泛存在于生物体内。抗菌肽的抗菌机理与通过阻断细菌生物大分子合成的抗生素抑菌机理完全不同,细菌不易产生耐药性,因此抗菌肽非常有望成为替代抗生素的新型抗菌药物。天蚕素是现有昆虫抗菌肽中最大的一族,具有抗菌谱广、毒副作用小、结构简单等优点,但是目前天蚕素的抑菌机理、结构与功能关系还不十分明确,这使的通过分子改造或全新设计生产,表达高活性抗菌肽的研究受到限制。本课题在前期研究天蚕素保守序列的基础上设计了四条抗菌肽AMPA/B/C/D。本论文将通过基因工程技术在大肠杆菌中表达四种抗菌肽,研究各抗菌肽的抑菌活性,并且利用生物信息学方法初步分析抗菌肽的结构与抑菌活性关系,为今后设计、表达活性更高的抗菌肽提供技术资料。AMPA/B/C/D全基因的合成及其克隆。根据大肠杆菌表达偏好密码子,将AMPA/B/C/D多肽序列反翻译为核酸序列;采用分段化学合成的方法合成全基因序列的5个DNA片段;利用PCR反应将短的DNA片段连接起来,并引入限制性内切酶位点ECORⅠ和HINDⅢ。四条全基因和载体PUC19分别经双酶切及连接反应,得到重组质粒PUC19AMPA/B/C/D。重组质粒转化“感受态”大肠杆菌JM109中,构建基因工程菌JM109A/B/C/D。测序分析表明四条抗菌肽全基因已经按照正确的阅读框插入到载体中。抗菌肽的诱导表达及溴化氰切割多肽。IPTG诱导工程菌并利用SDSPAGE凝胶电泳鉴定表达产物,结果表明表达产物以包涵体的形成存在。正交实验优化发酵条件后,大量培养工程菌。收集并破碎菌体,待菌体破碎完全后离心法分离得到包涵体。洗涤包涵体,除去附着的细菌膜蛋白等杂质。用6M盐酸胍/2M盐酸溶解包涵体,并加入溴化氰裂解表达产物,除去其N端的融合蛋白及部分信号肽。透析除去小分子后,冷冻干燥。利用稀释药敏实验和抑菌圈法测定设计抗菌肽抑菌活性。实验结果发现AMPA没有抑菌活性;AMPB/C/D均表现出广谱的抗菌活性,它们的最小抑菌浓度MIC约为9ΜM,其中AMPC对革兰氏阴性菌的抑菌效果最强,AMPD抗菌广谱性较AMPB/C差。利用生物信息学对设计抗菌肽二级结构、两亲性、电场分布、跨膜区域进行预测。对四种抗菌肽的预测和抑菌活性的关系初步分析表明AMPA/B/C/D二级结构都以Α螺旋结构为主,AMPC正离子性和两亲性较强,因此表现较高抑菌活性。
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    • 简介:研究背景洋地黄药物作为治疗充血性心力衰竭的正性肌力药物,自WILLIAMWITHERING首次报道从植物中提取“洋地黄”用以治疗充血性心力衰竭以来,应用于临床已有200多年历史,对其作用机制的的现代研究证实该类药物通过抑制NAKATP酶NKA酶活性而发挥正性肌力作用,虽然不足以解释其治疗量与中毒量30﹪的重叠这一严重制约了其在临床广泛应用的重大难题,但迄今尚无可以替代该类药物的新型高效低毒的强心药物。研究者观察到洋地黄药物通过与NKA酶暴露在细胞外的结合位点相结合发挥强心作用,由此推测在体内也应当有内源性配基LIGAND。本博士学位论文分为四部分,第一部分建立EDLS对体外培养人脐静脉血管内皮细胞HUVEC的作用模型,观察EDLS对HUVEC生长与功能的影响,初步研究其作用机制;第二部分建立双向凝胶电泳2DE图谱,构建对照组和EDLS刺激增殖的HUVEC的蛋白质图谱,比较蛋白质变化并寻找差异蛋白质第三部分利用电喷雾一离子阱串联质谱LIQUIDCHROMATOGRAPHYELECTROSPRAYIONISATIONMASSSPECTROMETRY/MASSSPECTROMETRY,LTESIMS/MS技术、查询数据库,鉴定差异蛋白质第四部分选取感兴趣的差异蛋白点进行功能验证,并探讨其在哇巴因作用中的机制。实验设计路线图如下本研究主要目的、方法、结果和结论概述如下研究目的研究EDLS对HUVEC生长的作用,并采用蛋白质组学方法阐述畦巴因在踟VEC作用的表达蛋白质谱,确定靶位蛋白分子,为开辟心血管疾病治疗的新途径奠定理论基础。研究方法1EDLS对血管内皮细胞作用的研究体外培养人脐静脉血管内皮细胞HUVEC,建立EDLS作用MYVEC模型,第24代用于实验。实验分组12H、24H、48H三个时间点,每一个时间点又分为对照组、哇巴因组、地高辛组和ETACRYNIC.ACID组。检测方法利用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法MTT法法观察不同浓度、不同药物对HUVEC生长增殖与凋亡的影响;台盼蓝染液检测细胞活性;形态学观察药物对细胞运动、黏附等功能的影响;透射电镜扫描明确细胞内超微结构变化;CASPASE3活性测定;流式细胞仪检测药物作用后细胞表达增殖、凋亡与坏死的不同表现;以期阐明EDLS对HUVEC生长的作用,初步探讨其作用机制。2EDLS刺激血管内皮细胞增殖作用的差异蛋白质筛选分别选取对照组和哇巴因刺激增殖HUVEC细胞,提取细胞总蛋白,进行蛋白质分离利用双向凝胶电泳2DE技术对两组样品的蛋白质分别进行分离,首先应用等电聚焦电泳IEF将蛋白质在不同PH的梯度进行分离,然后用SDSPAGE电泳将蛋白质在不同分子量梯度上进行分离;进行凝胶染色银染,用扫描仪获取蛋白质双向凝胶图谱;应用PDQUEST软件进行凝胶图像分析,寻找两组样品的差异表达蛋白点,为进一步深入研究哇巴因作用的靶位蛋白奠定基础。3EDLS作用血管内皮细胞的差异表达蛋白鉴定质谱鉴定重复2DE和质谱相容性银染,进行质谱鉴定,本实验使用FINNIGAN线性离子阱串联质谱仪LTQ进行液相色谱一串联质谱。质谱仪配置C18反相色谱柱,流动相MOBILEPHASEA和B分别为01﹪溶于超纯水及乙腈中的甲酸。所有测定均在正离子方式下进行。当进行LCESIMS/MS分析时,MICROSPRAY方式进样,系统装备一个C18脱盐预柱015MM120MM。毛细管温度为170度,毛细管电压为3000V。串联质谱扫描包括一个全扫描FULLMSSCAN及十个串联扫描MS/MSSCANS,搜索使用的数据库为IPI上人的非冗余蛋白库IPIHUMANV307FASTA,SEQUEST结果过滤参数为当CHARGE1,XCORR≥19;当CHARGE2,XCORR≥22;当CHARGE3,XCORR≥375;其中DELCN≥01。应用EXPASY蛋白质组学工具分析等电点、分子量及总平均亲水性,采用GO分类工具,从生物学途径、细胞组件及分子功能三方面对蛋白质表达谱进行功能分析及分类。4差异蛋白在EDLS作用HUVEC的表达及功能验证重复哇巴因作用HIJVEC模型的增殖模型,MTT测定细胞生长,流式细胞术测细胞周期,CASPASE3的活性测定凋亡,形态学检测细胞运动、黏附功能改变,提取细胞蛋白,WESTERNBLOT检测MYOSINREGULATIONLIGHTCHAIN2、PROFILIN1、HEATSHOCKPROTEIN60的表达,并应用PROFILIN1抗体干预哇巴因培细胞体系,观察对细胞生长的影响。阐述检测的差异表达蛋白在EDLS刺激HUVEC增殖中的机制。研究结果1EDLS对VEC生长的影响EDLS具有促进增殖和抑制生长的双重作用,其效应与时间和浓度相关。与空白对照组比较,低于20NMOL/L哇巴因药物浓度,培养时间在48小时以内为促进生长作用,作用高峰出现在10NMOL/L的浓度作用24小时高于50NMOL/L则呈现出抑制细胞生长作用,延长作用时间尤为明显。地高辛也表现出对细胞生长的双重作用,在低于50NMOL/L的浓度时为刺激细胞生长,高于此浓度则为抑制生长,且其抑制生长作用呈现浓度时间依赖性。流式细胞术和透射电镜超微结构检测表明EDLS促进VEC生长的影响为增殖,而其抑制细胞生长的作用在一定浓度范围内为诱发凋亡,高浓度则为凋亡与坏死并存的混合性死亡。非固醇类NAKATP酶抑制剂.ETACRYNICACID无促进细胞增殖作用,表明EDI。S在低于10NMOL/L时促进细胞增殖作用与其对NAKATP酶活性的抑制无关。2构建了稳定可靠的实验组和对照组2DE图谱,筛选EDLS刺激HUVEC增殖的差异表达蛋白点两组样品分别进行3次重复的2DE实验,获得6张2DE图像,分离出的蛋白质点数目对照组为2792±124,哇巴因作用组为2806±153,用PDQUEST软件进行图像的匹配分析,平均匹配率对照组为865﹪,哇巴因组为875﹪,重复性较好。差异蛋白点分析结果显示药物干预组与正常组蛋白点差异2倍以上的点有39个P005,其中增殖组差异4倍以上的点有8个P001。在得出的32个差异显著的蛋白质点中,哇巴因作用增高的点有18个,下降点为14个差异5倍的蛋白点,表达增高者5个,降低3个。3质谱鉴定分析差异蛋白点LTQESITOF/TOFMS鉴定其中具有显著差异的蛋白点,网上蛋白质库搜索比对后明确32个蛋白质,涉及细胞运动、代谢和信号转导等生物学功能。4差异蛋白的功能验证应用WESTERNBLOT检测差异蛋白MYOSINREGULATIONLIGHTCHAIN2、PROFILIN1、HEATSHOCKPROTEIN60在哇巴因作用叫VEC中的表达,检测结果与2DE结果吻合。进一步的研究表明PROFILIN1在哇巴因促进增殖VEC中表达增高P001,应用PROFILIN1抗体其增殖作用下降,进一步支持了本实验筛选得出的哇巴因作用VEC差异蛋白是其发挥促进VEC增殖的靶位蛋白和/或靶位蛋白,提供了具有潜在巨大价值的哇巴因作用靶分子。结论1EDLS在不同的浓度与作用时间对HUVEC作用不同,既可以促进增殖,又有诱导凋亡和坏死作用,在本研究中其促细胞增殖作用不依赖于对NAKATP酶活性的抑制。2EDLS促进MYVEC增殖的差异蛋白涉及细胞骨架、信号转导等功能蛋白,其作用途径不只传统意义上NAK.ATP.酶作用通路一条,而是通过多种机制作用于血管内皮细胞,以复杂的机制影响细胞生理病理各个过程,在心血管疾病的发生发展中发挥重要作用。3本研究通过蛋白质组学技术得到的哇巴因刺激血管内皮细胞增殖的靶蛋白之一细胞骨架蛋白PROFILIN1在哇巴因作用通路中发挥了重要作用。4本实验提供了EDLS在血管内皮细胞作用蛋白质表达的重要信息,为全面阐述EDLS作用分子机理提供了重要方法和新线索,为寻找新的心血管疾病治疗途径提供了有意义的靶分子,为探讨心血管疾病新的防治措施奠定了初步依据。
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      上传时间:2019-03-28
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    • 简介:华支睾吸虫成虫长期寄生于肝胆管部位所引起的疾病称华支睾吸虫病,又称肝吸虫病,是一种食源性的人兽共患寄生虫病。华支睾吸虫成虫轻度感染不会产生明显临床症状,易被忽视,患者长期带虫,虫体的分泌/代谢产物及虫体本身的机械刺激,对肝胆系统造成慢性损害,可引起胆管局限性扩张、胆管上皮增生、管壁增厚、管腔狭窄、胆管炎、胆管肝炎和肝硬化甚至诱发肝胆管肿瘤。流行病学调查结果显示华支睾吸虫病并发胆管癌的发生率高达14%476%,并且流行区胆管癌较肝细胞癌更多见;病理学资料表明华支睾吸虫成虫可引起胆管上皮脱落,胆管腺瘤样增生和炎症反应,晚期在腺瘤样增生边缘出现鳞状化生,胆管的腺瘤样增生组织产生退化及纤维化和恶性变;我国珠江三角洲地区的胆管癌患者很多都合并华支睾吸虫感染,有的甚至在癌组织切片中找到华支睾吸虫卵碎片,此种癌多数为低分化癌。人鳞状上皮癌肿瘤相关基因SQUAMOUSCELLCARCINOMARELATEDONCOGENE,SCCRO研究发现,该基因定位于人类染色体3Q263上,氨基酸序列含有螺旋环螺旋亮氨酸拉链结构,此结构与核转录因子类癌基因相类似,具有潜在转录因子作用。SCCRO转染的裸鼠具有形成未分化侵袭瘤的作用,并且与局部的淋巴结转移相关。SCCRO的大量表达与人类多种鳞状上皮癌的侵袭,转移密切相关。尽管有充分的证据表明,华支睾吸虫的感染是引发肝胆管癌的一个重要因素,但是至今仍缺乏明确的分子水平的实验证据;另一方面,华支睾吸虫是否存在与人鳞状上皮癌肿瘤相关基因相类似的基因,是否也具有与其相类似的作用都值得进一步探讨。研究目的从华支睾吸虫成虫CDNA文库中筛选出与人鳞状上皮癌肿瘤相关基因相类似的基因,探讨其与肝胆管癌发生、发展的关系,为华支睾吸虫感染引起肝胆管肿瘤提供分子生物学依据,同时丰富华支睾吸虫基因组学和功能基因组学研究。研究方法1华支睾吸虫CSSCCRO基因的发现和生物信息学分析从华支睾吸虫成虫CDNA文库测序后UNIGENE归并、拼接,获得与人鳞状上皮癌相关肿瘤基因相类似的基因,暂命名为CSSCCRO。测序、分析是否为全长基因,然后利用生物信息学分析软件对此基因的CDNA序列进行结构、性质和功能分析,包括核酸水平和氨基酸水平的同源性分析、以及推导的CSSCCRO蛋白的理化性质及空间结构分析。2华支睾吸虫CSSCCRO基因克隆、表达和WESTERNBLOTTING鉴定21华支睾吸虫成虫CSSCCRO基因的扩增、克隆根据目的基因的ORF和原核表达质粒PET30A设计引物,PCR扩增CSSCCRO基因的CDNA全长编码区。限制性内切酶XHOⅠ、ECORⅤ双酶切空质粒PET30A和PCR产物,T4连接酶连接。用PCR、酶切及测序鉴定。22华支睾吸虫成虫CSSCCRO基因的表达和纯化将PET30ACSSCCRO重组质粒转化的大肠杆菌BL21中表达,IPTG诱导后超声裂解破碎,最后用NINTAAGAROSE蛋白纯化柱纯化目的蛋白,核酸蛋白定量分析仪DU530BECKMAN测浓度。23华支睾吸虫成虫CSSCCRO蛋白的WESTERNBLOTTING鉴定采用SDSPAGE电泳和WESTERNBLOTTING方法,一抗分别用长期感染华支睾吸虫的猫血清和轻度感染的大鼠血清均为1100稀释,以GST1为阳性对照,来检测CSSCCRO蛋白的免疫原性。3华支睾吸虫CSSCCRO的细胞生物学功能初步研究31CSSCCRO蛋白刺激大鼠卵圆细胞的作用探讨将卵圆细胞接种于96孔板,待细胞生长稳定后按一定浓度加入目的蛋白刺激,以PBS为阴性对照进行MTT试验。在细胞生长的12H、24H、36H、48H、60H等五个时间点检测细胞492NM的吸光度,来反映细胞的生长变化;提取实验组和对照组细胞的总MRNA,通过RTPCR检测肿瘤转移相关基因CMYC和CD44表达量的变化。32将CSSCCRO基因转染入HELA细胞和大鼠肝卵圆细胞作用探讨构建PEGFPN1CSSCCRO真核重组质粒,脂质体法转染PEGFPN1CSSCCRO入HELA细胞和大鼠肝卵圆细胞,荧光倒置显微镜观察CSSCCRO的表达,为进一步的功能研究打下基础。研究结果1华支睾吸虫CSSCCRO基因的编码序列结构分析从华支睾吸虫成虫CDNA文库中发现与人鳞状上皮癌肿瘤相关基因相类似的基因,暂命名为CSSCCRO;CSSCCRO是完整的全长基因,该基因全长1218BP。其ORF含碱基780BP,起始密码子为ATG,终止密码子为TGA,编码259个氨基酸。其推导氨基酸序列与人鳞状上皮癌基因编码蛋白一致性达到50%,保守功能域分析发现该序列含有螺旋环螺旋亮氨酸拉链结构,与核转录因子类癌基因相似;其编码氨基酸理论分子量为30500,理论PI值546。2华支睾吸虫CSSCCRO基因克隆、表达和WESTERNBLOTTING鉴定用设计的引物PCR从CDNA文库中扩增CSSCCRO编码区CDNA序列,用琼脂糖电泳鉴定在略大于750BP处,测序确定为780BP。定向克隆获得的重组原核表达质粒PET30ACSSCCRO经PCR、双酶切和/或测序证实构建成功。重组质粒在IPTG终浓度1MMOL/L,28℃下诱导表达可溶性重组融合蛋白,经SDSPAGE显示与目的蛋白分子量相符,重组蛋白经亲和层析纯化后得到纯化后的目的蛋白。WESTERNBLOTTING证实长期自然感染华支睾吸虫的猫血清能与原核表达的CSSCCRO蛋白相结合,说明在华支睾吸虫长期感染过程中目的蛋白可以刺激机体产生抗体,具有一定的免疫原性。对于轻度感染华支睾吸虫的大鼠血清则不能与目的蛋白相结合,提示目的蛋白不宜作为感染早期诊断分子。3华支睾吸虫CSSCCRO的细胞生物学功能初步研究CSSCCRO蛋白刺激大鼠卵圆细胞的MTT结果显示目的蛋白在适当的浓度下利于细胞大鼠肝卵圆细胞的生长,。半定量PCR结果表明目的蛋白刺激后CMYC的表达量轻度升高,而CD44表达量则无明显变化。CSSCCRO能够在HELA细胞中高效表达,而在大鼠肝卵圆细胞中则很难见到绿色荧光蛋白的表达。这一方面可能与CSSCCRO蛋白对大鼠肝卵圆细胞有一定的毒性有关,另一方面,也可能与大鼠肝卵圆细胞自身特性不适于脂质体转染有关。研究结论1首次在华支睾吸虫中发现了与人鳞状上皮癌相关肿瘤基因同源性较高的基因,暂命名为CSSCCRO。2CSSCCRO蛋白能够促进大鼠肝卵圆细胞的生长,并且使肿瘤转移相关基因CMYC的表达量增加。这提示CSSCCRO在诱导肝胆管癌的发生、发展方面具有一定作用,也说明新发现基因暂命名为CSSCCRO有一定的可靠性。3CSSCCRO蛋白能被华支睾吸虫长期自然感染猫血清识别,却不能被短期轻度感染华支睾吸虫的阳性大鼠血清识别。这提示CSSCCRO可能为晚期感染相关因子,是否与感染晚期发生的肝硬化、肝胆管癌有关还有待进一步研究。
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